透明質酸對大鼠顆粒脂肪移植物存活影響的初步研究

陳嘯,章宏偉,李平松

(1.南京醫科大學江蘇南京210000;2.江蘇省蘇北人民醫院,揚州大學臨床醫學院,揚州大學附屬醫院江蘇揚州225000)

.基礎研究.

透明質酸對大鼠顆粒脂肪移植物存活影響的初步研究

陳嘯1,2,章宏偉1,李平松2

(1.南京醫科大學江蘇南京210000;2.江蘇省蘇北人民醫院,揚州大學臨床醫學院,揚州大學附屬醫院江蘇揚州225000)

目的:觀察透明質酸(hyaluronic acid,HA)對大鼠自體顆粒脂肪移植物存活的影響.方法:18只Wistar大鼠(雄雌不限,體重220±5g)背部皮下分別注射自體顆粒脂肪0.3ml、透明質酸0.3ml和自體顆粒脂肪與透明質酸混合物0.3ml(顆粒脂肪0.15ml+透明質酸0.15ml),并記為Fat組、HA組、Fat+HA組,分別于第30天、第60天、第90天,檢測移植物的體積并計算成活率;HE染色分析脂肪細胞的形態和移植物的炎癥反應;免疫組織化學染色檢測CD31表達,計數血管情況.結果:①注射Fat、HA、Fat+HA(1:1)0.3ml后,大鼠背部形成三個長條形的局部隆起,注射第15天HA組局部隆起消失,注射后第30天,第60天,第90天Fat+HA組移植物的成活率比Fat組高,具有統計學意義(<0.05);②局部取材切片(HE染色)可觀察到炎癥反應程度逐漸減輕,Fat+HA組誘發組織炎癥反應較Fat組為輕;③注射后第30天,第60天,第90天時CD31標記組織內血管計數Fat-HA組多于Fat組,具有統計學意義(<0.05).結論:透明質酸混合自體顆粒脂肪注射可以提高顆粒脂肪的成活率、促進移植物的再血管化、維持脂肪移植物的體積.

自體顆粒脂肪移植;透明質酸;軟組織充填

自體顆粒脂肪是一種良好的自體組織移植物,無排異反應,被整形美容外科運用于軟組織充填,然而脂肪移植物的低存活性及其體積存留的不可預知性限制了其在臨床的使用[1-4].因此為了維持自體脂肪移植后的療效,學者們對顆粒脂肪的獲取、純化、注射、儲存、受區的處理及生長因子的使用等方面[5-9]進行了大量研究,但仍未獲得滿意結果,而透明質酸具有抗炎性、親水性、促進組織重建等特點,各種修飾和未修飾的透明質酸已被廣泛運用于組織工程學、注射充填、治療關節炎等醫療方面[10-11].有研究表明透明質酸可以促進組織血管再生[12],那么透明質酸與自體顆粒脂肪混合移植能否促進自體顆粒脂肪移植物血管再生、能否改善顆粒脂肪的充填效果,目前關于這方面的研究還甚少.因此本實驗擬觀察透明質酸對大鼠皮下移植顆粒脂肪存活及移植物再血管化的影響,為臨床選擇合適的混合填充物提供有價值的科學依據.

1 材料和方法

1.1 主要材料與試劑

1.1.1 實驗動物:健康Wistar大鼠(由揚州大學醫學院動物試驗比較中心提供),雌雄不限,體重(220±5)g.

1.1.2 主要試劑:透明質酸,商品名:施沛特;規格: 2ml:20mg.

1.2 主要實驗方法和步驟

1.2.1 自體脂肪的切取:1%的戊巴比妥鈉(0.4ml/ 100g)大鼠腹腔內注射麻醉后,常規電動脫毛器備皮,5%碘伏消毒皮膚,在Wistar大鼠腹股溝內側設計皮膚切口長度2cm,皮下切取自體脂肪組織體積約2ml.

1.2.2 自體顆粒脂肪的純化:將獲取的自體脂肪樣本剪碎成1mm3的小組織塊,生理鹽水洗滌,去除血細胞、細胞碎片,將脂肪組織放置去針頭后的5ml空注射器中,注入生理鹽水后靜置,見分層現象出現后,上層為油脂、中間層為顆粒脂肪、最下層為沖洗液,從注射器中排出下部液體,反復沖洗3~4次,最后紗布濾過油脂和沖洗液可獲得純化的脂肪顆粒.

1.2.3 移植物在wistar大鼠背部皮下的注射:三種充填移植物為0.3ml自體顆粒脂肪(Fat)、0.3ml透明質酸(HA)、0.3ml混合移植物(Fat-HA)(0.15ml透明質酸+0.15自體顆粒脂肪)(見圖1),選擇lml注射器和15G針頭在大鼠背部皮下分別注射形成三個類長條形的隆起:大鼠頭側長條形為自體脂肪移植物、中間為透明質酸移植物、尾側為混合移植物(如圖2),分別記為Fat組、HA組和Fat+HA組.

圖1 三種充填物(Fat、HA、Fat-HA);圖2三種充填物皮下注射后即刻表現

1.2.4 移植物的大體觀察:移植物注射后第30天,第60天,第90天時分別隨機選取6只大鼠,觀察移植物局部皮膚的紅斑反應(0為無紅斑:1為輕度紅斑:2為中度紅斑:3為重度紅斑),背部做切口,剝離取出移植物,大體觀察移植物的顏色、形狀,使用注射器堆積法[13]測量體積,推算移植物成活率.

1.2.5 移植物的HE染色組織學觀察:10%甲醛固定標本24h,石蠟包埋切法進行HE染色,于光鏡觀察組織和脂肪細胞形態結構,每張切片沿縱向正中線等間距取5個視野,于200倍視野下計數完整脂肪細胞.完整脂肪細胞標準:未見明顯擠壓、變形,細胞壁完整清楚,細胞核清晰可見.

1.2.6 免疫組織化學法觀察移植物血管再生:血管內皮細胞染色方法CD31單克隆抗體作為第1抗體,按照免疫組化SP法操作步驟進行,DAB顯色,蘇木素復染.血管計數方法為每個切片沿縱向正中線等距取5個視野,于200倍視野下計數毛細血管數量,每個HP下微血管的個數即血管密度,然后求其均值,凡是染成棕色單個內皮細胞或內皮細胞族均作為1個血管計數.

1.2.7 統計學方法:采用SPSS14.0統計軟件進行分析,數據以均數±標準差表示,相同時間點不同移植物組成活率比較采用配對檢驗;不同時間點,同一移植物組成活率組間比較采用方差分析;周邊區血管計數進行成組設計的檢驗,<0.05認為有統計學差異.

2 結果

2.1 移植物大體觀察和體積測量:注射部位在每個時間點紅斑的程度不同:Fat組、Fat-HA組局部皮膚第1天時均為中度,隨后紅斑逐漸減輕,至第3天時均為輕度紅斑,第7天時,紅斑完全消失;HA組局部皮膚無紅斑反應.

移植物注射后第15天發現HA組局部隆起消失,第30天,第60天,第90天時宰殺6只Wistar大鼠,發現HA完全吸收消失,另兩種皮下充填物(Fat、Fat-HA)在皮下有明顯的占位,整體性好(見圖3),兩者在皮下組織中被吸收和隆起程度不同:注射第30天,試管堆積法測量存留物體積(見圖4) Fat組、Fat+HA組移植物的成活率分別為(73± 8)%、(90±7)%,比較有統計學差異(<0.05);注射第60天、第90天,Fat+HA組移植物成活率與Fat組比較均有統計學差異(<0.05)(見圖5).

圖4 試管堆積法測量存留物體積

圖3 三種充填物第90天時大體的表現;

圖5 移植物成活率比較(a,Fat-HA組與Fat組比較,<0.05; b,不同時間點Fat組比較,<0.05;c,不同時間點Fat-HA組比較,<0.05)

2.2 HE染色組織學觀察

Fat組:第30天,脂肪細胞呈團狀分布,包膜不完整,炎性細胞散在其間,細胞變性及膠原纖維增生較嚴重;第60天,脂肪細胞變性及膠原纖維增生明顯增多,殘余正常細胞分散孤立,未見正常脂肪小葉結構;第90天,完整脂肪小葉結構,見增生的膠原纖維及其間散在的脂肪細胞和破壞細胞融合后的大泡,炎性反應與第60天相似,但較同時間點Fat-HA組嚴重,Fat-HA組正常完整脂肪細胞計數均明顯多于Fat組(見圖6).

Fat-HA組:第30天,組織邊緣炎性細胞浸潤增多,但中心區炎性反應輕;第60天,脂肪炎性反應和細胞變性較第30天時減輕,仍以組織邊緣為主,可見正常脂肪小葉結構;第90天炎性反應與第60天相似,脂肪小葉結構正常可見,部分視野中組織結構好于第60天(見圖7).

圖6 第90天Fat組:脂肪細胞壞死再吸收顯著,炎癥反應明顯(X200)

;圖7第90天Fat-HA組:脂肪細胞形態良好,血管分布均勻(X200)

HA組:注射物第30天后無存留. 2.3免疫組織化學染色觀察:毛細血管的形態觀察結果:免疫組化染色后血管呈棕黃色,微血管形態不規則,管腔由染成棕黃色的內皮細胞圍成,腔內可見紅細胞;部分血管無明顯管腔,呈條索狀;有的只見到單個或成團的內皮細胞.

Fat組:第30天,炎性反應及血管形成增多,但仍以邊緣為主;第60天、90天,組織中央細胞破壞融合,膠原增生較實驗組明顯增多,血管主要分布于邊緣,內部少見(見圖8).

Fat-HA組:第30天,炎性細胞及增生膠原主要均勻分布,血管分布于組織邊緣及內部,形態較好,未見明顯擴張;第60天,血管分布較30天時增多,結構及形態接近正常;第90天,血管分布仍保持均勻,脂肪細胞及血管形態良好(見圖9).

HA組:無血管生成.

移植后第30天、第60天、第90天,Fat-HA組血管計數較Fat組多,有統計學差異(< 0.05);Fat組血管計數第90天較第30天多,有統計學差異(<0.05);Fat-HA組血管計數第90天,第60天均較第30天多,有統計學差異(< 0.05)(見表1).

圖8 第30天Fat組CD31標記毛細血管(X200);

圖9 第30天Fat-HA組CD31標記毛細血管(X200)

表1 兩組移植物不同時間毛細血管計數

3 討論

自體顆粒脂肪理論上是最理想的的軟組織填充材料.自Neuber于1893年率先用自體脂肪移植治療軟組織缺損至今已有一百多年歷史,脂肪移植開始在外科領域逐漸開展.隨著20世紀80年代脂肪抽吸技術的盛行,出現了以脂肪顆粒形式獲取脂肪移植物的簡便方法.此后,臨床醫生報道了脂肪顆粒注射進行脂肪移植的較多病例,如今脂肪自體移植已被臨床廣泛應用于整形美容外科.

許多學者對脂肪移植后的組織形態變化方面進行了相關研究.關于移植脂肪組織最終的轉歸,存在兩種理論:一種是"宿主取代理論",另一種是"細胞存活理論",Neuhof[14]在1923年提出"宿主取代理論",宿主的組織細胞(可能是巨噬細胞)浸潤,吞噬壞死脂肪細胞釋放出的脂質,以纖維組織形式最終取代移植脂肪中的脂肪細胞.Hausberger[15]和Gurney[16]提出"細胞存活理論"指的是脂肪移植后,移植脂肪組織中部分存活的細胞,而且起初的移植脂肪細胞去分化成一種前體細胞,稱之為脂肪前體細胞,并認為這類脂肪前體細胞能夠分化成為成熟的脂肪細胞."細胞存活理論"被廣泛接受,單純顆粒脂肪組織注射移植后,脂肪組織只能靠周圍組織液的浸潤和滲透來維持營養供應,超過該距離就需要生成新的血管來提供營分.越來越多的研究逐漸達成了共識,在自體顆粒脂肪移植后的轉歸過程中,移植早期建立充分和及時的血供,移植物及時地再血管化是影響其成活的關鍵.

判斷脂肪移植成功的標準是移植后脂肪是否能長期維持原來的體積不變,而體積的維持是由移植脂肪細胞在新的環境中存活而不被吸收來決定的.然而,至今沒有一個統一標準的可靠技術.在整形美容外科醫生中,Coleman技術[17]在脂肪移植中被廣泛運用.這一技術的關鍵步驟是將移植脂肪進行無創傷的處理以保證脆弱的脂肪細胞結構的完整,并且將脂肪顆粒分成小份將其注射在移植區的多個平面.這一方法將脂肪顆粒與移植受區充分接觸,使移植脂肪得到充分的營養和氧氣.所以筆者選擇長條形的注射方法,盡可能使脂肪顆粒與移植受區充分接觸.盡管小心翼翼地按照此方法注射,但移植脂肪還是有不同程度的吸收.即使是最熟練的醫生,移植脂肪的體積在移植后3個月都有所減少,據報道[18],移植脂肪的吸收率在人體達到25%~ 90%,動物體內達60%~70%.在對508位整形外科醫生的一項調查中,92%的醫生認為在脂肪移植后6個月脂肪有吸收,其中52%的醫生認為吸收率超過50%.因此脂肪的吸收阻礙了自體脂肪移植在臨床的應用.

為了維持移植脂肪的體積,目前的研究主要集中在取脂肪的技術,脂肪的處理及脂肪干細胞的移植,而我們的研究主要是利用透明質酸改善脂肪移植區的微環境.透明質酸(Hyaluronicacid,簡稱HA)也稱為透明質酸鈉、玻璃酸鈉,天然的HA是一種黏多糖,由葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基葡萄糖二聚體的重復序列組成的線性多聚體,是哺乳動物組織細胞外基質的一種成分,于細胞水平在許多生物過程起關鍵作用.聚合物交聯形成水凝膠,含有高度親水的成分,水凝膠已經被組織工程學用作細胞外基質模擬產生類似生理性的細胞培養微環境.透明質酸有許多重要的生物物理及生物化學特性,例如有對移植和細胞存活有利的生理性含水率,組織樣的彈性有力傳導作用,提供傳遞營養和細胞因子擴散的能力,通過與細胞的受體的相互作用提高細胞粘附的作用.作為水凝膠,透明質酸因其可用性,很好的生物相容性及其生物化學特點被應用于組織工程學[10].透明質酸做的不同孔徑的支架有利于脂肪干細胞的分化和增殖.通過為干細胞提供適當的細胞粘附,與細胞受體相互作用,激活細胞內的信號傳導,透明質酸能夠為干細胞的生長及分化提供一個很好的環境[19].

透明質酸有很多特性:①抗炎性:在炎癥早期,受損部位的HA來自炎癥區域的胞外基質細胞,或者來自供應受損部位的血管[20];HA通過與纖維蛋白凝塊相互作用而形成一個結構框架,從而調節宿主的炎癥反應并使胞外基質細胞遷移到受傷部位[21];HA還誘導成纖維細胞、角質細胞、成牙骨質細胞和成骨細胞產生一系列的多肽,即前炎癥因子,而促進炎癥應答和血管內皮細胞合成HA[22];HA還影響中性多形核細胞和巨噬細胞功能,包括它們的遷移、黏附、吞噬和殺傷入侵病原物質的作用[23];HA可作為前列腺素及其他生物活性分子的清除劑,從而抑制炎癥發生發展[24];②促進組織重建和創傷愈合:在組織修復過程中,H A與膠原蛋白、纖維蛋白及其他一些基質分子共同形成一個支持細胞遷移和黏附的暫時性支架,從而調節細胞黏附、遷移和分化[25];Chen等[26]認為HA是創傷愈合過程中的重要成分,它參與了創傷愈合的一系列高度調節而有序的過程,包括炎癥及肉芽組織形成、上皮修復和組織改建;③降解產物促血管生成:HA的相對分子質量是其具有促血管生成活性的決定因素,West等[27]的研究結果表明,透明質酸酶降解HA生成的o-HA可促進組織內新血管的生成.Sattar等[30]用o-HA處理小鼠背部皮膚,發現小鼠表皮下血管數量明顯增加.筆者的實驗結果也顯示透明質酸可以促進自體脂肪顆粒的再血管化.筆者選擇單純透明質酸(商品名:施沛特,主要成分為玻璃酸鈉,分子量:80萬~150萬)與自體脂肪混合移植;④親水性:HA具有較強的黏彈性和潤滑性,涂于皮膚表面,可形成一層保濕透氣膜,保持皮膚滋潤亮澤.低分子量的H A能滲透到真皮層,促進血液微循環,有利于皮膚對營養物質的吸收,起到美容抗皺的作用.

本研究采用動物實驗,發現單純脂肪移植與脂肪-透明質酸混合移植,脂肪的壞死有區別,差異在移植后第30天最明顯,但在第60天及第90天后沒有了區別;發現第30天單純透明質酸移植已基本完全被吸收;發現第30天單純脂肪移植組與脂肪-透明質酸混合移植,存留體積的比較有明顯差異.這一發現可能是因為以下原因,第一,當脂肪細胞移植入一個新的環境,他們會經歷一個缺血期,它們在血管生成前僅僅利用氧和養分的擴散來存活.這一階段大量的脂肪細胞死亡,而對缺血有更大的耐受力的前脂肪細胞存活下來并分化為新的脂肪細胞.透明質酸富含水分,一注入體內,就與周圍環境平衡,作為氧和養分的"存儲器".這些都有利于氧和養分進入脂肪細胞及代謝產物的排出.而且,當脂肪與透明質酸混合,有利于分離和分散注射的脂肪顆粒以防聚集,減少缺血,這與自體顆粒脂肪移植所要求的技術一致.單純脂肪移植物中心脂肪容易壞死,但是脂肪透明質酸混合物就沒有那么明顯.另一可能的原因是透明質酸成為脂肪組織的保護層防止炎癥細胞的侵入.

在移植后期,脂肪細胞依賴血供來存活.值得一提的是單純脂肪移植的脂肪壞死明顯,但脂肪透明質酸混合物沒有此現象.比較移植物的體積時,單純脂肪移植物體積的減少比脂肪透明質酸混合移植物體積減少的要小.當混合移植物的脂肪與單純脂肪移植物比較,體積要維持的大些.筆者推測移植后30天移植物體積的維持是透明質酸對早期脂肪壞死的抑制作用產生的.據我們所知,這是第一次將透明質酸輔助脂肪移植并客觀地測量移植物體積的實驗研究.單純脂肪移植用來觀察不同時間脂肪的成活率,單純透明質酸移植用來觀察不同時間透明質酸的存留率,到移植后30天,透明質酸完全降解消失,將會鑒別出脂肪透明質酸混合移植物中脂肪的成活率.

在體脂肪體積與離體是不一樣,脂肪移植后脂肪的體積有賴于可能的空間大小.換句話說,如果空間不夠,移植部位可能壓迫移植脂肪使其體積變小.所以我們選擇在大鼠背部皮膚比較松弛的部位作為注射點.筆者將不同移植物注射于同一大鼠皮下,可以減少個體的差異.筆者在不同的時間比較不同的大鼠是實驗的一個不足之處,以往的研究也表明不同的個體移植脂肪的體積存在差異,這點也得考慮到.

盡管以上提及的不足之處,實驗表明在動物體內透明質酸對于維持移植脂肪的體積具有明顯作用.將脂肪與透明質酸混合充填是一個新的充填方法,我們不知道最佳的混合比例,所以選擇1:1混合,這樣可以使脂肪細胞與透明質酸充分混合.以后會進一步研究不同比例混合的注射效果,設想如果只添加少量的透明質酸就能提高脂肪移植的成活率,會降低成本,為大量的脂肪移植提供一個可靠的方法.

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The preliminary study on the effect of hyaluronic acid on the survival of autologous fat graft in rats

CHEN Xiao1,2,ZHANG Hong-wei1,LI Ping-song2
(1.Nanjing Medical University,Nanjing 210000,Jiangsu,China;2.Northern Jiangsu People's Hospital, Clinical Medical School,Yangzhou University Affiliated Hospital to Yangzhou University,Yangzhou 22500,Jiangsu,China)

ObjectiveAutologousfattransplantationisacommontechniqueforsofttissue augmentation in aesthetic and reconstructive surgery;however,the degree of fat graft take can be unpredictable.Hyaluronic acidhas been shown to be a promising cell carrier in adipose tissue engineering.Objectives To investigate the effect of a hyaluronic acid on autologous fat graft survival, angiogenesis,and volume maintenance in rats.Methods Fat was harvested from the groins of 18 rats,processed,and injected beneath the animals'dorsums to form three grafts:one containing fat alone and one containing hyaluronic acid alone,one containing fat and hyaluronic acid in a 1:1 mix. The grafts were removed at 30th day,60th day,90th day,to measure fat graft volume and calculate the survival rate of the graft,as well as to observe the color,shape and volume of the grafts.. Histological studies were performed after sacrifice to evaluate fat necrosis and blood vessel density. Results All grafts were clinically viable.HA aft disappeared at 15th day after injection.The survival rate of Fat-HA graft of 30th day,60th day and 90th day were significantly higher than Fat graft(<0.05).At 30th day,60th day and 90th days after injection,blood vessel density in Fat-HA grafts was significantly greater than those in the grafts containing fat alone(<0.05).Conclusion When mixed with fat,hyaluronic acid can improve early fat graft survival and may enhance vascularity and prolong volume maintenance.

autologous fat graft;hyaluronic acid;soft tissue augmentation

R622 R332

A

1008-6455(2014)21-1793-06

2014-08-28

2014-10-23

編輯/張惠娟

章宏偉,男,教授,主任醫師.E-mail:zhanghw1966@aliyun.com