金鐵鎖活性成分基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及其產(chǎn)物評價研究進(jìn)展

云南中醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650500

金鐵鎖活性成分基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及其產(chǎn)物評價研究進(jìn)展

江舟錢子剛

云南中醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650500

對西南特有植物金鐵鎖的活性成分基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及其產(chǎn)物評價的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述，為金鐵鎖植物代謝途徑生物工程的應(yīng)用,研究和開發(fā)提供一定的理論依據(jù)。

金鐵鎖；三萜皂苷；生物合成；調(diào)控；評價

金鐵鎖(PsammosilenetunicoidesW. C. Wu et C.Y.Wu)為石竹科(Caryophllaceae)金鐵鎖屬(Pasmmosilene)植物[1]。主要分布于云南、四川、貴州等西南地區(qū)，是該地區(qū)特有的傳統(tǒng)藥用植物，是譽為“傷科圣藥”的云南白藥的主要組成藥材之一。

金鐵鎖又名獨丁子、獨定子、金絲矮陀陀、昆明沙參、白馬分鬃、獨鹿角姜、百步穿楊、穿石甲、蜈蚣七(云南)[2]，首載于《滇南本草》，謂其：“味辛，辣，性大溫，有小毒，吃之令人多吐。專治面寒痛，胃氣心氣疼，攻瘡癰排膿”[3]。長期以來作為商品的藥材全部依靠野生采挖，而金鐵鎖自然生長較緩慢，在經(jīng)濟利益驅(qū)使下采挖力度加大，使得野生資源迅速減少，現(xiàn)已作為稀有瀕危物種被列入《中國植物紅皮書》[4]。金鐵鎖野生資源已不能滿足日益增長的中成藥生產(chǎn)需求，而金鐵鎖五環(huán)三萜皂苷結(jié)構(gòu)復(fù)雜，天然資源來源有限，利用生物技術(shù)從分子水平上對金鐵鎖皂苷合成的關(guān)鍵基因進(jìn)行調(diào)控，促進(jìn)關(guān)鍵酶表達(dá)，提高五環(huán)三萜皂苷的產(chǎn)量構(gòu)建基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)并進(jìn)行產(chǎn)物評價研究已漸成趨勢，現(xiàn)就金鐵鎖活性成分基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及其產(chǎn)物評價研究概況綜述如下。

1 五環(huán)三萜皂苷基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

1.1 齊墩果烷型五環(huán)三帖的合成 自從“活體的異戊二烯法”被提出后，IPP和DAMPP被公認(rèn)為是萜類化合物的前體，其中甲羥戊酸(Mevalonic acid)生成的異戊烯基焦磷酸IPP(Isopentenyl Diphosphate)是“活化”的異戊二烯單元，在烯丙基轉(zhuǎn)移酶(Prenyltransferase)的催化作用下[5]，與其烯丙基異構(gòu)體DMAPP經(jīng)頭尾縮合生成香葉基焦磷酸(Geranyl diphosphate，GPP)，二磷酸合成酶(FPS)的催化作用下，GPP加上第二個IPP單元形成法呢基焦磷酸(Farnesyl diphosphate，F(xiàn)PP)，兩分子的FPP在鯊烯合酶(Squalene synthase，SS)催化作用下“頭對頭”縮合連接形成三萜鯊烯[6]，黃素蛋白在O2和NADPH等輔助因子的參與下催化鯊烯生成2,3-氧化鯊烯(Squalene-2,3-oxide)，2,3-氧化鯊烯在2,3-氧化鯊烯環(huán)化酶(Oxidosqualene cyclase OSCs)的催化下，形成三萜皂苷元骨架[7-8]。整個三萜皂苷生物合成的關(guān)鍵酶屬于一個超家族，由催化甾體生物合成的環(huán)阿屯醇合成酶和催化各種三萜骨架形成的三萜合成酶家族組成。齊墩果烷型五環(huán)三萜類衍生物的骨架為β-香樹素，其合成酶為β- 香樹素合酶(β-amyrin synthase，β-AS)。由于大多數(shù)植物的三萜皂苷是由齊墩果烷和達(dá)瑪烷衍化得來的，所以β-香樹素合酶對齊墩果烷型五環(huán)三帖皂苷的合成非常重要。三萜皂苷元骨架形成皂苷需要復(fù)雜的后期修飾才能獲得最終的齊墩果烷型五環(huán)三帖皂苷產(chǎn)物[9]。

1.2 三萜合成的關(guān)鍵酶 根據(jù)萜類合成的不同階段，以及酶在萜類合成中的不同作用，可將萜類合成酶分為前期、中期、后期酶，鯊烯合酶(SS)屬于前期合成酶；β-香樹素合酶屬于中期合成酶；P450單加氧酶和糖基轉(zhuǎn)移酶是后期酶，烯丙基轉(zhuǎn)移酶和萜類環(huán)化酶催化的合成的產(chǎn)物通過后期酶的結(jié)構(gòu)修飾生成最終產(chǎn)物。

1.2.1 鯊烯合酶(SS) 鯊烯是合成三萜、甾醇、膽固醇等萜烯類重要物質(zhì)的共同前體。鯊烯合酶一種結(jié)合在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的膜結(jié)合酶，是催化兩分子的法呢基焦磷酸(FPP)縮合產(chǎn)生鯊烯(SQ)的關(guān)鍵酶，而SS的含量和活性決定了后續(xù)產(chǎn)物的產(chǎn)量，使得科學(xué)界對SS的研究非常重視。1978年Agnew和Popjak首次用脫氧膽酸從酵母中分離得到可溶不穩(wěn)定的SS開始[10]，科學(xué)家們先后從動物組織和植物，植物細(xì)胞和微生物細(xì)胞中提取、分離和純化了SS，1991年Jennings[11]通過功能互補法，利用缺失SS基因的酵母突變株與基因組DNA文庫克隆了SS基因。自從煙草中分離得到SS基因開始，已有諸多物種的SS基因被克隆并被用于各分子研究。Kim T D[12]發(fā)現(xiàn)SS基因的過表達(dá)可使人參中甾醇和人參皂苷含量提高，Seo[13]將人參鯊烯合酶基因在刺五加中表達(dá)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株SS活性提高3倍，同時轉(zhuǎn)基因植株的刺五加三萜皂苷類成分增加2～2.5倍，戴住波[14]克隆獲得并采用原核表達(dá)體外酶促反應(yīng)、GC和GC-MS等方法進(jìn)行了初步功能鑒定的金鐵鎖鯊烯合酶cDNA，為金鐵鎖次生代謝工程研究奠定了重要的基礎(chǔ)。

1.2.2 β-香樹素合酶及茉莉酸甲酯調(diào)控 五環(huán)三萜碳環(huán)的生物合成只要是通過氧化鯊烯環(huán)化酶(OSC)的環(huán)化作用生成，β-AS隸屬于氧化鯊烯環(huán)化酶(OSC)家族，能催化2,3-氧化鯊烯形成齊墩果酸型五環(huán)三萜的母核β-香樹素，是齊墩果酸形成的關(guān)鍵酶，1998年Kushior[15]采用PCR第一次從人參毛狀根中克隆到β-AS的cDNA；Dauenpen Meesapyodsuk[16]利用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)，在釀酒酵母中表達(dá)，分離并鑒定出一種由cDNA編碼的β-AS(SvBS)，該β-AS主要在王不留行Saponaria vaccaria (Caryophyllaceae)的葉中進(jìn)行表達(dá)；趙壽經(jīng)[17]采用RT-PCR克隆了人參β-AS基因，并構(gòu)建了反義植物表達(dá)載體。

茉莉酸甲酯(MeJA)普遍存在于植物界，能夠顯著增強基因表達(dá)從而增加植物抗毒素及次生代謝產(chǎn)物量，Suzuki[18]使用MeJA處理紫花苜蓿(Medicago truncatula)后發(fā)現(xiàn)SS基因表達(dá)量大幅提高，β-AS基因表達(dá)量增加約30倍，而次生代謝產(chǎn)物皂角苷含量增加了10倍；Yanling LIU[19]通過MeJA誘導(dǎo)秦艽，β-香樹素合酶的表達(dá)量在48小時后達(dá)到頂峰，相較于沒有誘導(dǎo)的植株，經(jīng)過誘導(dǎo)的植株齊墩果酸的含量最大量達(dá)到1.2mg/g；劉家佳[20]使用RT-PCR和RACE克隆了金鐵鎖β-AS全長cDNA，構(gòu)建金鐵鎖β-AS基因大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，通過大腸桿菌BL21(DE3)表達(dá)了金鐵鎖β-AS。

1.2.3 細(xì)胞色素P450單氧酶及糖基轉(zhuǎn)移酶 五環(huán)三萜碳環(huán)合成后需要經(jīng)過復(fù)雜的后期修飾作用，而細(xì)胞色素P450單氧酶及糖基轉(zhuǎn)移酶參與了這一過程。細(xì)胞色素P450是一類B族細(xì)胞色素超基因家族編碼的蛋白酶，因還原態(tài)與一氧化碳結(jié)合后在450nm處有一吸收峰而得名。就三萜皂苷皂苷碳環(huán)骨架合成而言，大多數(shù)細(xì)胞色素P450都起到催化羥化和氧化等一系列修飾作用。自1969年Frear首次發(fā)現(xiàn)植物中存在P450后，直到1990年Bozak[21]才從燕麥果實中將第一個植物細(xì)胞色素P450克隆出來，Durst[22]將細(xì)胞色素P450分為兩組，參與五環(huán)三萜皂苷合成的植物細(xì)胞色素P450因為具有均一的特征序列，屬于A組，而非A組的細(xì)胞色素P450則不局限于植物，而參與生命體活動必須的物質(zhì)合成。Qi[23]等發(fā)現(xiàn)細(xì)胞色素P450酶CYP5H10能催化β-香樹素脂醇轉(zhuǎn)化為燕麥皂苷；Carell[24]等使用激活標(biāo)簽法和定向誘導(dǎo)技術(shù)鑒定了蒺藜苜蓿細(xì)胞色素P450酶CYP716A12并證明CYP716A12催化β-香樹素脂醇C-28位氧化生成齊墩果酸。

糖基轉(zhuǎn)移酶催化三萜皂苷元與糖通過糖苷鍵相連，糖基轉(zhuǎn)移酶家族成員眾多，具高度專一性，已知序列的糖基轉(zhuǎn)移酶沒有明顯的同源性，但有相似結(jié)構(gòu)域。自2005年Kohara[25]等首次從刺茄中克隆得到糖基轉(zhuǎn)移酶SaGT4A，研究人員已先后從苜蓿，甘草等植物中分離得到并鑒定糖基轉(zhuǎn)移酶。目前關(guān)于金鐵鎖的細(xì)胞色素P450單氧酶及糖基轉(zhuǎn)移酶的相關(guān)研究進(jìn)展還未見報道，就金鐵鎖的細(xì)胞色素P450單氧酶及糖基轉(zhuǎn)移酶還有待深入研究。

1.3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)基因發(fā)根系 發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobacterium rhizogenes)能侵染大多數(shù)的雙子葉植物、少數(shù)單子葉植物及個別的裸子植物，在植物轉(zhuǎn)基因方法中，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和基因槍法的應(yīng)用廣泛。特別是農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，因其具有易操作、低費用、高效率、插入片段確定性好和轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)低等獨特優(yōu)點，已經(jīng)成為轉(zhuǎn)基因策略中的首選方法。發(fā)根農(nóng)桿菌能誘發(fā)被感染植物的受傷部位長出冠纓瘤和毛狀根。根癌農(nóng)桿菌和發(fā)根農(nóng)桿菌中細(xì)胞中分別含有Ti質(zhì)粒和Ri質(zhì)粒，其上有一段T-DNA，農(nóng)桿菌通過侵染植物傷口進(jìn)入細(xì)胞后，可將T-DNA插入到植物基因組中[26]。研究發(fā)現(xiàn)，Ri質(zhì)粒轉(zhuǎn)化系統(tǒng)比Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化系統(tǒng)具有一定的優(yōu)越性而被廣泛重視。選擇攜帶Ri質(zhì)粒的發(fā)根農(nóng)桿菌，在工程菌感染后會得到發(fā)根，之后對單克隆進(jìn)行增殖，篩選生長迅速快，且有效成分含量高的克隆。李景濱[27]利用發(fā)根農(nóng)桿菌ACCC10060菌株侵染金鐵鎖幼葉及莖段，建立金鐵鎖毛狀根離體培養(yǎng)系統(tǒng)。趙爽[28]用發(fā)根農(nóng)桿菌A4和C58C1菌株分別誘導(dǎo)金鐵鎖外植體獲得毛狀根，對維生素Cef濃度篩選，AS對毛根誘導(dǎo)，外植體的選擇，預(yù)培養(yǎng)時間，侵染時間和共培養(yǎng)時間等毛狀根誘導(dǎo)過程中的因素進(jìn)行優(yōu)化，成功建立了金鐵鎖毛狀根誘導(dǎo)體系。

2 金鐵鎖活性成分評價以及機制研究

2.1 化學(xué)成分 金鐵鎖的化學(xué)成分主要為皂苷、環(huán)肽、內(nèi)酰胺、糖類、有機酸和氨基酸等物質(zhì)。近幾年研究主要集中在五環(huán)三萜皂苷及環(huán)肽類化合物，主要有效成分是齊墩果烷型五環(huán)三萜皂苷類物質(zhì)。1989年浦湘渝[29]首次從金鐵鎖根中提取分離得到2個齊墩果烷型五環(huán)三萜皂苷，將總皂苷水解后得到絲石竹酸、絲石竹苷元、表絲石竹苷元、16-異皂樹酸、16-異皂樹酸甲酯和3β-羥基-12,17-二烯-28-失碳齊墩果烷-23-醛共6種皂苷元；鐘惠民[30-31]先后發(fā)現(xiàn)9個五環(huán)三萜皂苷化合物，屬于齊墩果烷型；秦學(xué)玲[32]選擇金鐵鎖提取物中3-O-6＇-甲基-β-D葡萄糖醛酸絲石竹苷作為指標(biāo)性成分，并對其含量及純度進(jìn)行測定，建立了含量檢測的HPLC方法；項世軍[33]等采用HPLC建立1、3、5年生金鐵鎖的多組分指紋圖譜，為金鐵鎖的鑒別和質(zhì)量控制提供依據(jù)。

2.2 藥理作用 金鐵鎖有著廣泛的藥理活性，研究表明其水煎液、醇提液及總皂苷具有顯著的鎮(zhèn)痛抗炎作用[34]。許建陽[35-36]等發(fā)現(xiàn)金鐵鎖水煎浸膏對實驗性RA小鼠關(guān)節(jié)痛具有顯著的鎮(zhèn)痛作用，金鐵鎖水煎浸膏明顯提高痛閾、降低血清NO/NOS。王美娥[37]等發(fā)現(xiàn)金鐵鎖水煎浸膏提高實驗性RA疼痛模型痛閾值，能改善血液循環(huán)，活血化瘀止痛，提高疼痛級別，改善功能障礙，提示其水煎浸膏具有明顯的鎮(zhèn)痛、抗炎、解熱作用。楊蓮[38]等采用了熱板法、扭體法觀察金鐵鎖各提取分離物對昆明種小鼠的鎮(zhèn)痛作用。金鐵鎖70%乙醇總浸膏與金鐵鎖總皂苷對扭體法模型有明顯的鎮(zhèn)痛作用，表明金鐵鎖具有明顯鎮(zhèn)痛作用,其鎮(zhèn)痛作用部位可能在外周。王學(xué)勇[39-40]研究表明金鐵鎖的總皂苷能有效抑制佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠的急性炎癥反應(yīng)，對足腫脹有明顯抑制作用，其作用機理與抑制AA大鼠促炎細(xì)胞因子水平以及炎性疼痛中樞及外周組織中c-fos基因的表達(dá)有關(guān)。另外，金鐵鎖總皂苷能明顯抑制巴豆油至炎小鼠鼠耳腫脹程度，并對慢性增值性炎癥也有一定的抑制作用[41]。

3 結(jié)語

金鐵鎖是西南特有的國家級保護藥用植物，是云南白藥的重要組成成分之一，還是許多中成藥的原料用藥。近年來研究表明其植物體活性成分尤其是五環(huán)三萜皂苷類物質(zhì)在鎮(zhèn)痛抗炎，調(diào)節(jié)免疫，殺菌抑菌等方面作用確切。大量的商業(yè)藥用需求與金鐵鎖野生資源日漸稀缺形成了矛盾，目前對金鐵鎖活性成分基因調(diào)控及產(chǎn)物評價的研究還較少，可以從研究金鐵鎖五環(huán)三萜皂苷代謝途徑，建立基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，通過基因工程方法克隆金鐵鎖五環(huán)三萜皂苷代謝途徑中的關(guān)鍵酶基因進(jìn)行序列分析和分子生物學(xué)手段增強關(guān)鍵酶的基因表達(dá)，進(jìn)而增強代謝途徑的代謝強度，調(diào)控五環(huán)三萜皂苷的生物合成，從而提高金鐵鎖五環(huán)三萜合成前體和下游產(chǎn)物的含量入手，著重闡明代謝途徑及其調(diào)控機理是提高金鐵鎖五環(huán)，為基礎(chǔ)研究以及實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)金鐵鎖五環(huán)三萜皂苷奠定基礎(chǔ)。為瀕危藥用植物生物合成途徑關(guān)鍵酶基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及其產(chǎn)物研究提供范例。

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ResearchprogressinthenetworkofactiveingredientsgeneregulationandproductsevaluationofPsammosilenetunicoides

JIANG Zhou QIAN Zi-gang

Yunnan University Of TCM，Kunming 650500,China

This paper reviewed the network of active ingredients gene regulation and products evaluation ofpsammosilenetunicoides.and would establish a foundation for the study and utilization of bioengineering and molecular biology inPsammosilenetunicoides.

Psammosilenetunicoides；Triterpene saponin；Biosynthesis；Regulation；evaluation

國家自然科學(xué)基金資助項目(81260609)。

江舟(1981-)，女，云南人，實驗師，在讀碩士研究生，研究方向：中藥資源開發(fā)與利用。

R285

A

1007-8517(2014)05-0025-03

2014.01.05)