α-硫辛酸對電點燃致癇大鼠行為學及海馬p38MAPK表達的影響

房海波， 王維平， 王洪超， 臧紅敏， 甄軍麗， 馬彩云， 王 偉

癲癇(Epilepsy)是一種常見的、慢性反復發作的神經系統綜合征，可導致嚴重的神經元凋亡或壞死，從而影響患者的認知功能和社會生活，并給家庭和社會帶來沉重的負擔。因此，深入研究癲癇發作后神經元凋亡的分子機制，探索有效的抗凋亡藥物具有重要的意義。p38MAPK是絲裂原活化蛋白激酶家族的成員之一，當受到各種應激刺激時p38MAPK被激活，進而通過多條信號轉導通路引起神經元凋亡。α-硫辛酸(α-lipoic acid，α-LA)是一種強效的天然抗氧化劑，在神經變性疾病、缺血再灌注損傷、多發性神經病等疾病中發揮顯著的抗氧化作用。然而，其在癲癇和凋亡方面的研究還很少。本實驗應用α-LA對杏仁核電點燃大鼠進行干預，通過觀察大鼠行為學表現，檢測海馬p38MAPK、p-p38MAPK蛋白表達水平及海馬神經元凋亡率，從而初步探討α-LA發揮神經保護的效果及其可能的機制。

1 材料和方法

1.1 電極植入過程及檢測 點燃前后發放閾值(afterdischarge threshold，ADT)大鼠麻醉后固定于腦立體定位儀上，刺激電極插入左側杏仁核(前囟后 2.8 mm，左旁開 4.8 mm，顱骨下 8.6 mm)，腦電圖描記電極、參考電極和接地電極分別插入右額部、左、右側頂枕交界區，插入深度為顱骨下接近硬腦膜即可，牙托樹脂和502膠水固定，恢復1 w，檢測點燃前ADT(刺激參數為:單向方波脈沖，脈沖持續時間1.0 ms，頻率 60 Hz，串持續時間為 1.0 s。刺激電流強度從100 uA開始，每隔5 min增加40 uA直至腦電圖上出現至少持續3 s的后放電為止。刺激電流強度超過700 uA仍未出現后發放的大鼠將被剔除)。

1.2 動物分組及模型制備 雄性Wistar大鼠36只，由河北醫科大學實驗動物中心提供，起始體重280±20 g，SPF級。隨機分為以下6組，每組6只。正常對照組:不給予任何處理;α-LA組:每天給予α-LA(40 mg/kg)(德國史達德大藥廠)腹腔注射一次;假手術組:杏仁核植入電極后不給予任何處理;電刺激模型組(ES組):植入電極后每天以120%的點燃前ADT刺激一次;電刺激+α-LA低劑量組(電低α-LA組):植入電極后每天給予α-LA(20 mg/kg)腹腔注射30 min后以120%的點燃前ADT刺激一次;電刺激+α-LA高劑量組(電高α-LA組):植入電極后每天給予α-LA(40 mg/kg)腹腔注射30 min后以120%的點燃前ADT刺激一次，連續刺激15 d。依據Racine評價標準觀察大鼠的行為學表現，記錄每只大鼠第一次達到每個發作等級所需的累積刺激數及累積后發放持續時間(duration of afterdischarges，ADD)。最后一次刺激結束后按檢測點燃前ADT的方法檢測ES組、電低α-LA組和電高α-LA組的點燃后ADT。

1.3 Western blot檢測海馬 p38MAPK及 pp38MAPK的表達水平 模型制備完成后，每組6只大鼠均采用斷頭取腦并快速分離海馬，提取總蛋白，測蛋白濃度，取50μg蛋白95℃ ～98℃變性5 min，以非連續Tris-SDS聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳，電轉到硝酸纖維素膜上。脫脂奶粉室溫封閉1 h，兔抗大鼠p38MAPK多克隆抗體(1:300，美國Bioworld公司)、兔抗大鼠p-p38MAPK多克隆抗體(1:300，美國Bioworld公司)4℃過夜，漂洗5次，山羊抗兔IgG熒光抗體(1:4000，Rockland公司)室溫避光1 h，漂洗5次，遠紅外熒光掃描成像系統(Odyssey公司)掃描并測定目標蛋白單位光密度值，與GAPDH(1:400，美國Bioworld公司)比值后，做統計學分析。

1.4 碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)染色檢測海馬神經元凋亡率 海馬組織置放于70% 乙醇中4℃保存24 h，將組織置于180目鋼絲濾網上，剪碎組織后用小鑷子輕輕搓組織，邊搓邊用生理鹽水沖洗，將沖洗液轉移到塑料試管內，過濾沖洗液一次，4℃，1000 rpm，離心4 min，留取沉淀，加入500 μl PI染液，4℃冰箱靜置30 min后檢測。

1.5 統計學分析 實驗結果用均數±標準差(χ±s)表示，運用Spss13.0軟件進行處理，采用完全隨機設計資料方差分析和配對t檢驗進行顯著性差異分析，運用SNK法檢驗進行組間比較。

2 結果

2.1 行為學檢測結果 (1)與ES組相比，電高α-LA組達到第一次Ⅴ級發作所需的累積刺激數明顯增多(P＜0.05)，點燃后 ADT明顯增高(P＜0.05)。ES組、電低α-LA組和電高α-LA組達到第一次Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級發作所需的累積刺激數之間的差異無統計學意義(P＞0.05)。(2)與ES組相比，電低α-LA組和電高α-LA組達到第一次Ⅴ級發作所需的累積ADD明顯縮短(P＜0.05)。ES組、電低α-LA組和電高α-LA組達到第一次Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級發作所需的累積ADD之間的差異無統計學意義(P＞0.05)。(3)ES組、電低α-LA組和電高α-LA組點燃后ADT較點燃前ADT明顯降低(P＜0.05)。

2.2 Western Blot結果 各組之間 p38MAPK表達水平的差異無統計學意義(P＞0.05)。電低α-LA 組(2.20 ±0.04)和電高 α-LA 組(1.26 ±0.93)的 p-p38MAPK表達水平較 ES組(3.39±0.09)明顯降低(P＜0.05);并且電低 α-LA組的海馬p-p38MAPK表達水平明顯高于電高α-LA組(P＜0.05)。ES組、電低α-LA組和電高α-LA組海馬p-p38MAPK表達水平明顯高于正常對照組(0.62±0.05)、α-LA 組(0.64 ±0.05)和假手術組(0.56 ±0.06)(P ＜0.05)。

2.3 細胞凋亡率檢測結果 電低 α-LA組(11.71 ±0.52)和電高 α-LA 組 (8.65 ±0.38)的海馬神經元凋亡率較ES組(14.83±0.60)明顯降低(P＜0.05);并且電低α-LA組海馬神經元凋亡率明顯高于電高α-LA組(P＜0.05)。ES組、電低α-LA組和電高α-LA組的海馬神經元凋亡率明顯高于正常對照組 (1.72 ±0.46)、α-LA 組 (1.53 ±0.37)和假手術組(1.91 ±0.60)(P ＜0.05)。

3 討論

癲癇發作可致腦部神經元凋亡，海馬等邊緣系統的神經元凋亡尤為明顯［1］。神經元凋亡可導致神經膠質細胞增生、苔蘚纖維出芽及海馬硬化，進而促進癲癇發展。癲癇動物模型具有與人類癲癇相似的行為和腦電圖特征，電點燃是目前普遍采用的動物模型制備方法，該模型具有如下優點:(1)一旦建立，腦內興奮性神經元可保持數月;(2)在發作行為、癇樣放電擴散及腦電圖等方面與人類癲癇相似;(3)電極位置可由實驗者自由選擇，以便控制癲癇灶的位置;(4)發作時間容易控制，重復性好;(5)動物對刺激反應性好，死亡率低。因此，本實驗采用杏仁核電點燃方法制備慢性癲癇大鼠模型。

α-硫辛酸(α-LA)是天然抗氧化劑中作用最強的一種，也是存在于多種酶復合物中的天然輔因子［2］。在許多類型細胞中，α-LA對活性氧簇誘導的凋亡具有保護作用。α-LA既具有水溶性又具有脂溶性，這一重要的特性使得它能夠順利通過血腦屏障從而保護腦內的神經元［3］。已有研究表明，α-LA能夠通過降低興奮性氨基酸水平并提高抑制性氨基酸水平來發揮癲癇后的神經元保護作用［4］。本實驗結果表明，與ES組相比，應用α-LA干預后癲癇發作等級降低，達到相同發作等級所需的累積刺激數增加、累積ADD縮短，點燃后的ADT增高，其原因可能為α-LA能夠減少癲癇發作后神經元的凋亡數量，從而降低大鼠對電刺激的敏感性，故達到相同的發作等級需要更多的電刺激數。同時受到相同強度的刺激后，比ES組大鼠更難于發作，故點燃后的發放閾值增高。由于α-LA干預的大鼠每次的ADD都比ES組短，因此達到相同的發作等級所需的累積ADD也比ES組縮短。

p38MAPK是絲裂原活化蛋白激酶家族中的重要成員之一，其催化域內的VII和VIII子域之間具有蘇氨酸-甘氨酸-酪氨酸(TXY)雙重磷酸化結構域［5］。通常情況下，p38MAPK按下列方式次序激活:MAPKKK-MAPKK-p38MAPK［6］，MKK3 和 MKK6是激活p38MAPK的兩種相對特異性的絲裂原活化蛋白激酶激酶［7］。此外，p38MAPK還能夠通過非依賴 MAPKK的機制發生自動磷酸化［8］。通常，p38MAPK以無活性的形式存在于細胞質內，當被激活后轉化為具有活性的磷酸化形式［9］。研究表明，神經生長因子剝奪及Fas結扎誘導的細胞凋亡中都存在P38MAPK的激活［10］，P38MAPK的特異性抑制劑SB203580能夠抑制水楊酸鈉誘導的FS-4纖維母細胞凋亡［11］及谷氨酸鹽誘導的小腦顆粒細胞凋亡［12］。由此表明，p38MAPK與凋亡之間存在著密切關系。在凋亡反應中p38MAPK通路的功能即可以是caspase的上游也可以是其下游。此外，p38MAPK還可以通過激活p53、促進氧自由基和彈性蛋白酶的釋放、上調TNFα的活性等方式參與調節細胞凋亡。本研究發現，癲癇發作后海馬組織內p-p38MAPK蛋白表達水平明顯上調且海馬神經元凋亡率明顯增加，應用α-LA干預后能劑量依賴性地降低海馬組織內p-p38MAPK蛋白表達水平和海馬神經元凋亡率。

總之，根據上述的實驗研究結果，我們推測α-LA對癲癇大鼠的海馬神經元具有保護作用，可能與其下調p-p38MAPK蛋白的活性有關。

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