姜黃素通過清除小膠質細胞內活性氧類物質保護多巴胺能細胞

崔群力， 李巖琦

既往對帕金森病的研究多是從多巴胺能神經元的角度來探索PD的發病機制，自從在PD患者腦和動物模型中發現黑質致密部除了有大量DA能神經元缺失外，還有膠質細胞的大量增生［1］，免疫炎癥反應在PD發病中的作用被日益受到重視［2］。炎癥反應在腦中的標志是腦中的固有細胞-小膠質細胞的激活［3］。抑制小膠質細胞過度激活和炎癥反應過程可能代表了在PD中減少神經元變性的一個治療方向。

姜黃素是食用香料姜黃的主要成分，具有抗氧化［4］、抗炎作用，能夠調節和抑制小膠質細胞的表達和遷移［5］。為此，我們采用神經生長因子誘導過的PC12細胞作為細胞模型，以魚藤酮作用于BV-2細胞后，以含有炎性細胞因子的條件培養液處理PC12細胞，觀察PC12細胞的存活率及凋亡現象，探討小膠質細胞激活后對多巴胺能神經細胞的影響，研究姜黃素抑制小膠質細胞激活及保護多巴胺能細胞的機制。

1 材料和方法

1.1 試劑 姜黃素、魚藤酮購自美國Sigma公司;其余試劑為國產分析純。姜黃素于DMSO中配成20 mmol/L儲液，-20℃儲存，用時以完全培養基稀釋成工作液;魚藤酮于DMSO中配成1 mmol/L儲液，-20℃儲存，用時用完全培養基稀釋成工作液。

1.2 細胞培養

1.2.1 PC12細胞培養在高糖DMEM培養基中，內含10%胎牛血清。在通有5%CO2的37℃的培養箱中培養，隔天換液一次。細胞豐度達70% ～80%時傳代一次，并于細胞豐度達70% ～80%時進行試驗，每次實驗前更換含10%胎牛血清DMEM培養基培養48 h。BV-2細胞培養在含10%胎牛血清的高糖DMEM培養基中，在體積分數為5%CO2的37℃的培養箱中培養，隔天換液一次，細胞豐度達70%～80%時傳代一次，并于試驗前更換培養基。

1.2.2 條件培養液處理PC12細胞 姜黃素預處理BV-2細胞4 h加入所需終濃度的魚藤酮共孵育6 h，收集培養上清，作為PC12細胞的條件培養液(microglia conditioned medium with curcumin，MCMC)。實驗前更換PC12細胞的培養基，將條件培養液加入PC12細胞繼續培養。在細胞培養后的24 h觀察細胞存活率及凋亡。

1.2.3 分組和藥物處理 取魚藤酮和姜黃素母液，按適當比例用完全培養基稀釋成工作液，DMSO的含量小于0.1%。魚藤酮組藥物終濃度分別為:5 nmol/L、10 nmol/L、20 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L、0.5 μmol/L 和1.0 μmol/L，孵育時間為 24 h。姜黃素藥物終濃度分別為 0.1 μmol/L、0.5 μmol/L、1 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L。姜黃素預處理4 h后按要求加魚藤酮至所需終濃度(部分檢測指標只涉及姜黃素 0.5 μmol/L、1 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L;魚藤酮10 nmol/L)。另設姜黃素組(只加姜黃素)及無藥物處理組。

1.3 檢測指標及方法

1.3.1 噻唑藍(MTT)比色法檢測細胞活力將對數生長期細胞離心、收集，將細胞沉淀重懸于培養基中，將成團細胞反復吹打制成單細胞懸液，計數并調整至適當的細胞濃度1×108-9/L，按1×104-5個細胞/孔接種(每孔加細胞懸液90μl)于96孔培養板，每組6個復孔。另設調零孔不接種細胞，只加培養基，其他條件相同。姜黃素藥物終濃度分別為0.1 μmol/L、0.5 μmol/L、1 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L;魚藤酮組分別加入適量的魚藤酮稀釋液(每孔10μl)，使其終濃度分別為 5 nmol/L、10 nmol/L、20 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L、1 μmol/L 和 10 μmol/L;姜黃素預處組姜黃素藥物終濃度分別為0.5 μmol/L、1 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L，4 h 后按要求加魚藤酮至所需終濃度(10 nmol/L)共孵育6 h，對照組不加任何藥物(每孔終體積100μl)。孵育24 h后每孔加入10μl MTT(5 mg/ml)，37℃繼續孵育4 h，加入100μl DMSO，振蕩10 min至甲月贊顆粒充分溶解，在570 nm波長下用酶標儀測定各孔OD值。

1.3.2 蘇木素、伊紅染色觀察BV-2細胞形態學改變 將消毒好的多聚賴氨酸包被的蓋玻片置于六孔板中，然后接種適當濃度的BV-2細胞。待細胞貼壁后，加入姜黃素使其終濃度為0.5μmol/L、1 μmol/L、5μmol/L，預處理4 h后，加入魚藤酮至終濃度為10 nmol/L，同時設魚藤酮組和空白對照組，置37℃5%、CO2細胞培養箱培養24 h;棄去培養液，取出蓋玻片，自來水沖洗。4%多聚甲醛固定30 min;蘇木素染色10 min，自來水沖洗多余染液，1%鹽酸乙醇分化數秒鐘，自來水沖洗;1%氨水(Scotte氏液)中返藍數秒鐘，自來水沖洗;1%伊紅乙醇染色3 min，自來水沖洗;自然風干后，中性樹膠封片，光鏡下觀察攝像。

1.3.3 DCGH-DA染色法檢測BV-2細胞內活性氧類物質(ROS)水平 DCFH-DA(2’-7’-二氯熒光乙酰乙酸鹽)是一種能自由通過細胞膜的染色劑，其本身不發出熒光，當被細胞內ROS氧化為熒光化合物DCF時便發出熒光。通過檢測DCF的熒光強度，反映細胞內ROS的水平。分組及藥物處理:姜黃素預處理組(0.5 μmol/L、1 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L)4 組;魚藤酮組;空白對照組，共6組。按要求加入姜黃素使其終濃度為0.5μmol/L、1 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L，預處理 4 h 后，加入魚藤酮終濃度為10 nmol/L，空白對照組不加任何藥物培養基培養，置37℃ 5%、CO2細胞培養箱培養24 h。按照試劑盒說明書進行操作。小心抽去細胞培養液體并收集細胞。進行流式細胞儀檢測:波長488 nm氬離子激光，觀察50000個以上細胞，波峰右移表明活性氧(ROS)含量高。

1.3.4 annexin V-FITC/PI雙染法，流式細胞儀檢測PC12細胞的凋亡。

1.3.4.1 檢測原理 磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine，PS)正常情況下位于細胞膜的內側，但在細胞凋亡的早期，PS可翻轉到細胞膜的表面，暴露在細胞外環境中。annexin V與PS有高度親和力，故可通過細胞外側暴露的PS與凋亡早期細胞的胞膜結合。碘化丙啶(propidine iodide，PI)是一種核酸染料，它不能透過完整的細胞膜，但在凋亡中晚期的細胞和死細胞PI能夠透過細胞膜而使細胞核紅染。因此，用annexinV與PI雙染色，可以將凋亡早晚期的細胞以及死細胞區分開來。

1.3.4.2 操作步驟

1.3.4.2.1 分組及藥物處理 姜黃素預處理組(0.5 μmol/L、1 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L)4組;魚藤酮組;空白對照組，共6組。按要求于BV-2細胞培養瓶內加入姜黃素使其終濃度為0.5μmol/L、1 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L，預處理 4 h 后，加入魚藤酮至終濃度為10 nmol/L，空白對照組不加任何藥物培養基培養，置37℃ 5%、CO2細胞培養箱培養6 h;然后搜集培養液作為PC12細胞的條件培養液(MCMC)，將條件培養液加入到相應組PC12細胞培養瓶繼續培養48 h。

1.3.4.2.2 各組細胞按要求處理后 離心收集細胞，PBS洗滌2次，收集約1×105個細胞。加入500μl的Binding Buffer懸浮細胞;加入5μl annexin V-FITC混勻后，加入 5μl PI，混勻;室溫、避光、反應5～15 min;1 h內進行流式細胞儀檢測(激發波長:488 nm;發射波長:530 nm)。

1.3.4.2.3 結果判斷 在雙變量流式細胞儀的散點圖上，左下象限顯示活細胞，為(annexin V-/PI-);右下象限為早期凋亡細胞，顯現(annexin V+/PI-);右上象限是晚期凋亡細胞，為(annexin V+/PI+);而左上象限顯示壞死細胞，為(annexin V-/PI+)。

1.4 統計學處理 檢測結果采用均數±標準差(χ±s)表示，全部數據由SPSS13.0軟件進行統計學分析，多組數據間的顯著性分析采用單因素方差分析，兩組數據間的顯著性分析采用t檢驗。

2 結果

2.1 MTT檢測細胞增殖活力 條件培養液對PC12細胞增殖活力的影響:姜黃素在低濃度(0.5 μmol/L～10μmol/L)時對 PC12細胞及BV-2細胞活力無明顯影響;魚藤酮(10 nmol/L)對PC12細胞及BV-2細胞活力無明顯影響(資料未提供)。所以，我們選用姜黃素濃度(0.5μmol/L～10μmol/L)和魚藤酮(10 nmol/L)進行隨后的實驗。對照組、魚藤酮(10 nmol/L)組、姜黃素預處理組(姜黃素藥物終濃度分別為 0.5 μmol/L、1 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L，預處理4 h后，與終濃度10 nmol/L的魚藤酮共孵育BV-2細胞6 h，收集培養液作為PC12細胞的條件培養液)共6組。結果顯示:魚藤酮組與對照組比較，PC12細胞活力顯著降低(P＜0.01);姜黃素預處理的條件培養液使PC12細胞活力增加，與魚藤酮組比較有顯著統計學差異(P＜0.05)。

2.2 姜黃素對魚藤酮致敏BV-2細胞形態學改變的影響 空白對照組:BV-2細胞突起明顯，成雙極狀;魚藤酮組:BV-2細胞激活，大多呈阿米巴樣;各姜黃素干預組:BV-2細胞形態有所恢復，以1.0μmol/L姜黃素干預組細胞形態恢復最明顯。

2.3 DCGH-DA染色法檢測BV-2細胞內活性氧類物質(ROS)水平 以DCFH-DA熒光強度反映ROS水平，空白對照組細胞的ROS水平為100±9.39%。應用魚藤酮10 nmol/L處理24 h后，可使細胞內產生大量的活性氧，熒光強度增加，細胞ROS水平升至對照組的187.9±20.5%，差異有極顯著統計學意義(P＜0.01)。分別給予0.5μmol/L、1.0 μmol/L、5.0 μmol/L、10 μmol/L 姜黃素預處理4 h后和10 nmol/L魚藤酮共同孵育24 h，可拮抗ROS的生成，熒光強度明顯降低，其中1.0μmol/L和5.0μmol/L姜黃素的抑制作用最強。上述各濃度姜黃素預處理組的細胞ROS水平分別為空白對照組的 167.9 ± 18.5%、142.9 ± 15.1%、137.1 ±17.6%和151.0±16.8%。0.5 μmol/L 姜黃素組與魚藤酮組比較差異有顯著統計學意義(P＜0.05);1.0 μmol/L、5.0 μmol/L、10 μmol/L 姜黃素組與魚藤酮組比較差異有極顯著統計學意義(P＜0.01)。

2.4 annexin V-FITC/PI雙染法，流式細胞儀檢測PC12細胞的凋亡 對照組、魚藤酮(10 nmol/L)、姜黃素預處理組(姜黃素藥物終濃度分別為0.5 μmol/L、1 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L，預處理4 h后，與魚藤酮終濃度10 nmol/L共孵育BV-細胞6 h)共6組。收集以上各組培養液作為PC12細胞的條件培養液，繼續培養24 h。

流式圖顯示:空白對照組的細胞凋亡率為3.6±1.4%;魚藤酮處理組，細胞凋亡率升至41.3±5.1%，與對照組比較差異有統計學意義(P＜0.01)。0.5 μmol/L、1 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L各姜黃素條件培養液組PC12細胞凋亡率分別為:34.6 ± 2.8%、21.6 ± 3.0%、26.7 ± 4.1%、32.8 ±1.9%，與魚藤酮組比較有統計學差異(P＜0.05)。

3 討論

PD是一種神經變性疾病，以中腦黑質多巴胺能神經元進行性丟失為特征，并且多巴胺能神經元的丟失在PD癥狀出現前多年就已經開始。近年來，越來越多的研究認為炎癥反應是神經系統變性疾病共有的重要特征［6］。在炎癥反應過程中，小膠質細胞被認為是關鍵的因素。

小膠質細胞是腦中的固有細胞，在海馬、基底節和中腦小膠質細胞密度最高［7］，在中腦這個區域也是PD多巴胺能神經元受損最嚴重的區域。研究證明:小膠質細胞受到某些因素的刺激激活介導的炎癥反應增加了外源性刺激或毒素對神經元的破壞。小膠質細胞無控制的激活導致了神經變性疾病的慢性進展，是PD進行性發展的驅動力［8］。在無小膠質細胞存在時，MPTP誘導的急性神經毒性是非進展性的;而在小膠質細胞存在時，MPTP誘導了很強的、進展性的多巴胺能神經元變性［9］。而且，藥物抑制小膠質細胞激活或者敲除編碼各種炎癥介質的基因可以抑制MPTP或LPS誘導的多巴胺能神經元的進行性損害［10］。總之，過度的炎癥反應，無論是作為起始因素還是繼發反應都促發了神經變性疾病慢性、進展性的過程。

因此，抑制小膠質細胞介導的炎癥反應，阻斷炎癥反應介導的對神經元損傷的惡性循環，從而預防或減緩神經變性疾病的進展，這可能代表了神經變性疾病的一個治療方向。姜黃素是食用香料姜黃的主要成分，具有抗氧化、抗炎作用。最近的研究亦顯示:姜黃素能夠通過抗炎作用防護6-羥多巴胺、MPP﹢和MPTP誘導的神經變性;能通過抑制NF-κB和AP-1同DNA的結合來抑制LPS誘導的BV-2細胞 COX-2基因表達［11］;能通過 NF-κB 信號通路抑制促炎癥細胞因子的轉錄而發揮抗炎作用［11］。為此，我們采用姜黃素預處理BV-2細胞的條件培養液來觀察魚藤酮誘導的小膠質細胞的炎癥反應對PC12細胞的影響。

我們的研究結果顯示，0.5μmol/L～10μmol/L姜黃素條件培養液組與魚藤酮組比較PC12細胞活力明顯增強，1.0μmol/L和5.0μmol/L姜黃素組的條件培養液對PC12細胞活力影響最顯著(P＜0.01)。因為魚藤酮是細胞線粒體復合物I抑制劑，能夠抑制線粒體對氧的利用，從而產生大量ROS。我們推測姜黃素可能通過直接清除BV-2細胞內的ROS保護多巴胺細胞。于是，我們測定BV-2細胞內的ROS結果顯示姜黃素明顯減少了魚藤酮誘導的BV-2細胞內的ROS的含量，且以1.0μmol/L和5.0 μmol/L姜黃素作用最強(P ＜0.01)。我們分析:魚藤酮抑制BV-2細胞線粒體呼吸鏈對氧的利用，產生大量ROS;而BV-2細胞內ROS的增多又可作為刺激因素促使BV-2細胞釋放其它炎癥介質［12，13］;BV-2 細胞內 ROS 滲透到細胞外及其產生的炎癥介質造成PC12細胞的凋亡［14］。姜黃素通過清除BV-2細胞內 ROS，從而抑制BV-2細胞的激活，減少炎癥介質的產生，保護了多巴胺能細胞。

本實驗研究證實，姜黃素通過減少小膠質細胞內ROS的生成，或直接清除細胞內ROS，阻斷了小膠質細胞激活的惡性循環，從而保護多巴胺能細胞。

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