黃芩素對人乳腺癌MDA-MB-231細胞株SATB1表達的影響*

張淑群 高曉燕 薛興歡 馬一楠 馬興聰

·基礎研究·

黃芩素對人乳腺癌MDA-MB-231細胞株SATB1表達的影響*

張淑群 高曉燕 薛興歡 馬一楠 馬興聰

目的：觀察黃芩素對人乳腺癌MDA-MB-231細胞SATB1蛋白表達的影響。方法：用MTT法、劃痕愈合實驗觀察不同濃度黃芩素干預后MDA-MB-231細胞增殖和運動遷移能力的變化；用Western Blot法檢測黃芩素干預后MDA-MB-231細胞SATB1蛋白表達的變化。結果：隨作用時間的延長和藥物濃度的增加，黃芩素對MDA-MB-231細胞增殖和運動遷移的抑制作用逐漸增強，呈明顯的時間-劑量依賴性（P＜0.05）；黃芩素可顯著降低MDA-MB-231細胞中SATB1蛋白的表達，而且隨著藥物濃度增加，SATB1蛋白表達量逐漸減少（P＜0.05）。結論：黃芩素可通過抑制SATB1的表達抑制腫瘤細胞的惡性增殖、侵襲和遷移能力。

黃芩素 SATB1 乳腺癌 細胞株

Department of Oncology,the SecondAffiliated Hospital of Xi'an Jiaotong University School of Medicine,Xi'an 710004,China

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China(No.81274136),Xi'an Jiaotong University's

Cross Project Funds(No.Xjj2012141),and the Talent Funds of the Second Affiliated Hospital of Xi'an Jiaotong University(No.RCCGG201105)

乳腺癌在全球女性腫瘤病死率中排第二位［1］，患者死亡的主要原因是腫瘤細胞在身體其他部位的播散和增殖，約有50%的乳腺癌患者初診時已有遠處轉移［2-3］，因此目前治療的難點和關鍵是預防和控制腫瘤的轉移。特異富含AT序列結合蛋白1（special AT-rich sequence binding protein 1，SATB1），是一種組織特異性核基質結合蛋白，在胸腺細胞、祖細胞和上皮基底層顯著表達，在其他正常細胞和組織中幾乎不表達，參與染色質高級結構的形成和組織特異性基因表達的調控，在T細胞的發育、早期紅細胞分化，細胞穩態和響應各種刺激中起重要作用［4-10］。近來研究發現SATB1在多種腫瘤細胞中異常高表達，能調控1 000余種腫瘤相關基因，促進腫瘤的生長和轉移。被認為是一個潛在的重要的抗腫瘤藥物作用的靶分子。

黃芩素是從中藥黃芩中分離出來的單體，其分子式為C15H10O5，分子量為270.24（圖1）。研究發現黃芩素在人乳腺癌、肝癌、胰腺癌等細胞株中具有抑制腫瘤細胞增殖和侵襲轉移的作用［11-13］。然而其抗腫瘤生長和轉移的具體分子機制尚不清楚。本研究結果提示，在人乳腺癌MDA-MB-231細胞中黃芩素可通過抑制SATB1蛋白的表達而發揮抗腫瘤侵襲轉移作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料和試劑

人乳腺癌細胞株MDA-MB-231購自上海生物研究所細胞庫；黃芩素購自美國Sigama公司，純度為99%；兔抗人SATB1多克隆抗體購自美國Abcam公司；鼠抗人β-Actin單克隆抗體（美國Santa Cruz公司）；辣根過氧化物酶標記二抗購自北京博奧森生物有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養及藥物處理 MDA-MB-231細胞加入含10%胎牛血清的1640培養基，當細胞鋪滿瓶壁80%時傳代。

1.2.2 MTT法檢測黃芩素對MDA-MB-231細胞增殖的影響 取對數生長期的細胞，制成濃度為5×104個/mL的細胞懸液，以200 μL/孔種于96孔板，孵育24 h。用含10%血清的1640培養液將黃芩素儲存液（0.1 M）配置成終濃度為5、10、20、40、80 μmoL/L的培養液。96孔板中加入200 μL不同濃度的黃芩素培養液。空白對照組加入200 μL普通細胞培養液。每個濃度設6個平行復孔。繼續培養分別于24 h，48 h，72 h后，加入MTT溶液（5 mg/mL）20 μL，培養4 h后棄掉原液，加入MDSO 150 μL/孔。振蕩10 min，酶標儀在490 nm波長下測定各孔光密度（optical density，OD）值，記錄結果。細胞增殖抑制率（inhibition ratio，IR），IR=（1-實驗組平均OD值/對照組平均OD值）×100%；計算出黃芩素的48 h的50%抑制濃度（IC50）。

1.2.3 劃痕試驗檢測黃芩素對MDA-MB-231細胞遷移能力的影響 按1.0×105個/mL密度，將細胞接種于6孔培養板中，當細胞生長融合達80%時，用200 μL的移液器槍頭劃痕，記錄劃痕區相對距離。加入含黃芩素濃度分別為0、10、20 μmol/L的維持培養液繼續培養，分別于0、24、48 h 3個時間段分別觀察并照相。每組2個復孔，實驗重復3次。倒置顯微鏡下測量細胞向劃痕區遷移的相對距離，根據原始細胞劃痕區寬度計算出細胞實際遷移距離。

1.2.4 Western Blot法檢測黃芩素對MDA-MB-231細胞SATB1蛋白表達的影響 RIPA裂解液提取細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，10%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，半干轉印到PVDF膜，5%的脫脂奶粉中封閉90 min，加一抗（SATB1 1.25∶1 000，β-actin 1：1 000）4℃過夜；洗膜后加入1：1 000的二抗稀釋液室溫下孵育1 h。ECL顯色曝光，凝膠成像系統進行掃描分析；實驗重復3次。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 黃芩素體外抑制MDA-MB-231細胞的增殖

與對照組比較，黃芩素在24、48、72 h及各濃度（5、10、20、40、80 μmol/L）均對MDA-MB-231細胞有抑制作用。隨著藥物濃度的提高和培養時間的延長，黃芩素對MDA-MB-231細胞的抑制作用逐漸增強，即具有時間-劑量依賴性（表1，圖2）。通過SPSS 18.0軟件計算出黃芩素對MDA-MB-231細胞作用48 h的半數增殖抑制濃度（IC50）為27.92 μmol/L。

2.2 黃芩素對MDA-MB-231細胞體外遷移能力的影響

細胞運動能力的檢測也是一種判斷腫瘤細胞轉移潛能的方法。本實驗將待測細胞分為3組，對照組、10 μmol/L及20 μmol/L黃芩素干預組。倒置顯微鏡下可見對照組與濃度為10 μmol/L的黃芩素組MDA-MB-231細胞形態無明顯變化，而作用48 h后濃度為20 μmol/L黃芩素干預組細胞形態發生明顯變化，由原來的長梭形變為類圓形。分別于劃痕后0、24、48 h觀察并記錄細胞劃痕區的愈合情況。黃芩素干預組劃痕區細胞遷移的數量明顯少于對照組，藥物干預組與對照組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。隨著藥物濃度的提高，劃痕區愈合寬度明顯減少（圖3）。

表1 黃芩素對人乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖的影響（±s，n=6）Table 1 Inhibitory effects of Baicalein on MDA-MB-231 cell migration（±s，n=6）

Concentration（μmol·L-1）24 h 48 h 72 h 0 5 OD 0.406±0.031 0.482±0.013 IR（%）0 -22.84 OD 0.603±0.036 0.533±0.051 IR（%）0 13.20 OD 0.981±0.027 0.841±0.063 IR（%）0 14.27

表1 黃芩素對人乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖的影響（±s，n=6）（續表1）Table 1 Inhibitory effects of Baicalein on MDA-MB-231 cell migration（±s，n=6）

Concentration（μmol·L-1）10 20 40 80 24 h 48 h 72 h OD 0.408±0.052 0.338±0.029 0.316±0.016 0.264±0.014 IR（%）-6.53 20.63 27.26 42.67 OD 0.507±0.033 0.356±0.025 0.283±0.022 0.207±0.023 IR（%）18.18 46.90 60.49 74.76 OD 0.824±0.025 0.465±0.011 0.212±0.030 0.193±0.014 IR（%）20.08 52.60 78.39 80.33

2.3 Western Blot檢測黃芩素對MDA-MB-231細胞SATB1蛋白表達的影響

根據MTT法檢測結果求出的黃芩素對MDA-MB-231細胞增殖的48h半數抑制濃度（IC50），選用濃度分別為0、10、20、40 μM的黃芩素處理細胞MDA-MB-231 48 h后，分別提取細胞總蛋白用于Western Blot檢測。結果如圖4所示，與空白對照組比較，不同濃度的黃芩素（10、20、40 μM）分別干預MDA-MB-231細胞48h后，SATB1蛋白的表達均降低，差異有統計學意義（P＜0.01），且隨藥物濃度的提高，SATB1蛋白表達量逐漸減少（P＜0.05）。說明黃芩素可降低MDA-MB-231細胞中SATB1蛋白的表達，且呈濃度依賴性。

3 討論

癌細胞的異常生長和轉移是癌癥的重要生物學特性。侵襲轉移是數百萬癌癥患者發病和死亡的主要原因［14］。篩選有效的不良反應小的抗腫瘤侵襲轉移藥物，對提高乳腺癌療效、改善預后、提高生存質量，具有重要的意義。黃芩素是從黃芩中提取出來的黃芩苷苷元化合物，研究顯示其具有較強的抗癌活性，可抑制乳腺癌細胞系MCF-7、MDA-MB-231、BT549、4T-1的增殖、降低其侵襲遷移能力及，可使MMP-2、MMP-9、uPA、NF-κB蛋白表達下調［11，15-18］，但具體作用機制目前尚不清楚。本研究采用MTT法觀察不同濃度梯度黃芩素對MDA-MB-231細胞增殖的影響，結果顯示黃芩素具有抗腫瘤細胞增殖的作用，且呈時間-劑量依賴性（P＜0.05）。遷移是腫瘤細胞轉移過程中必不可少的環節之一；劃痕愈合實驗被廣泛用于二維水平細胞遷移運動能力的研究。本實驗發現黃芩素具有抑制乳腺癌MDA-MB-231細胞運動遷移的作用。這同Wang等［11］的研究報道一致。

SATB1是一種組織特異性的核基質結合蛋白，它以獨特的“籠狀”結構錨定于染色質，能為眾多轉錄因子提供作用位點，在基因轉錄過程中發揮重要作用［7］。Han等［19］發現SATB1在乳腺癌組織中異常高表達，可促進乳腺癌細胞的生長和轉移，在腫瘤演進過程中發揮關鍵作用。基因組學研究發現SATB1通過調控1 000個以上基因（主要是調控細胞粘附、細胞信號、ECM形成和細胞周期）的表達促進腫瘤侵襲轉移。SATB1水平增加的細胞其促進腫瘤發展和轉移的基因上調（包括ERBB2、MMP2，3，9、ABL1、E-cadherin），而轉移抑制基因的表達被抑制。這些SATB1所調控的基因是通過比較高侵襲性人乳腺癌細胞MDA-MB-231細胞在SATB1基因敲除前后基因表達譜的變化得出的。Zhang等［20］報道在結腸癌組織中，SATB1的表達與多種生物學和遺傳學標記的表達呈正相關（包括Cyclin D1、MMP2、NF-κB、PCNA），同時與APC和BRAF（V600E）表達的缺失相關。本研究黃芩素是否通過抑制SATB1的表達從而發揮抗腫瘤細胞增殖及侵襲轉移的作用。實驗結果發現小劑量黃芩素干預乳腺癌MDA-MB-231細胞，可下調SATB1蛋白的表達，且隨劑量增加抑制作用顯著增強（P＜0.01），提示下調SATB1蛋白表達可能是黃芩素抑制乳腺癌侵襲轉移的機制之一。

綜上所述，黃芩素可顯著抑制人乳腺癌MDA-MB-231細胞的增殖、侵襲和轉移，提示黃芩素可能具有潛在的抑制腫瘤細胞增殖、侵襲和轉移的作用。本實驗首次發現黃芩素可下調SATB1蛋白的表達，提示黃芩素可能通過抑制SATB1的表達而發揮抗腫瘤侵襲轉移的作用。為闡明黃芩素抗腫瘤的作用機制提供了新的研究思路。其詳細確切機制仍需進一步深入研究。與此同時SATB1的表達可也作為一個新的工具，以評估乳腺癌的惡性程度，并且有望成為新的治療靶點。

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（2013-12-05收稿）（2014-02-22修回）

（本文編輯∶周曉穎）

Effect of Baicalein on the expression of SATB1 in MDA-MB-231 cells

Shuqun ZHANG,Xiaoyan GAO,Xinghuan XUE,Yinan MA,Xingcong MA
Correspondences to:Shuqun ZHANG;E-mail:zhangshuqun1971@aliyun.com

Objective:To investigate the effect of Baicalein on SATB1 expression and its relation to proliferation,invasiveness and migration of MDA-MB-231 cells.Methods:Colorimetric 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT) and wound healing assays were used to detect the cell proliferation and the migration changes of MDA-MB-231 cells when treated with different concentrations of Baicalein.SATB1 expression in MDA-MB-231 cells was detected by Western blot.Results:Along with the reaction time and increase drug concentration,the inhibitory effect of Baicalein on proliferation and migration of MDA-MB-231 cells gradually increased in a time-and dose-dependent manner(P＜0.05).After treatment with Baicalein for 48 h,an obvious decrease was observed in the level of SATB1 protein expression of MDA-MB-231 cells in a dose-dependent manner(P＜0.05).Conclusion:Baicalein can suppress MDA-MB-231 cells growth and migration by inhibiting its proliferation in a time-and dose-dependent manner.It can also down-regulate the expression of SATB1.

Baicalein,SATB1,breast cancer,MDA-MB-231 cells

10.3969/j.issn.1000-8179.20132064

張淑群 醫學博士，副主任醫師，副教授，博士、碩士研究生導師，研究方向為乳腺癌的中藥干預。

西安交通大學醫學院第二附屬醫院腫瘤科（西安市710004）

*本文課題受國家自然科學基金面上項目（編號：81274136）、西安交通大學交叉項目基金（編號：Xjj2012141）和西安交通大學第二附屬醫院人才基金（編號：RCCGG201105）資助

張淑群 zhangshuqun1971@aliyun.com

E-mail∶zhangshuqun1971@aliyun.com