精子DNA碎片化檢測在男性生殖領域的臨床應用

陳 亮 徐 陽

北京大學第一醫院生殖與遺傳醫療中心（北京 100034）

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精子DNA碎片化檢測在男性生殖領域的臨床應用

陳 亮 徐 陽

北京大學第一醫院生殖與遺傳醫療中心（北京 100034）

人工授精（IUI）、體外受精（IVF），特別是胞漿內單精子注射（ICSI）等輔助生殖技術（ART）的廣泛應用，解決了嚴重精子異常不育患者的受精難題[1-3]。由于精液常規分析（SA）只是對于精子的活動率及形態進行大致的分析，對ART診療策略的制定及助孕結局預測評估的作用價值非常有限。從分子層面檢測精子DNA損傷程度、選擇DNA損傷較小的精子對提高ART妊娠成功率大有裨益。雖然精子DNA損傷碎片化檢測尚處于初步探索階段，對其認知存在不同學術觀點，具體發生機制尚未完全明了，但不可否認，越來越多的研究結果提示精子DNA損傷性檢測對于評估男性生育力及預測ART結局顯示出不可低估的作用。本文對精子DNA損傷碎片化檢測研究動向及其在男性生殖領域內的臨床應用做一述評。

一、精子DNA損傷導致碎片化的病因及發生機制

精子DNA損傷是指在精子生成及成熟過程中，各種原因導致DNA完整性被破壞而產生斷裂的碎片。精子DNA損傷也是多因素共同作用、精子自身抗損傷機制失衡導致的結果，與生殖道感染、睪丸溫度升高、精索靜脈曲張、放療及化療、吸煙、激素及環境污染包括天氣霧霾等因素有關。霧霾天氣中重金屬及有害物質會導致精子DNA鏈斷裂和甲基化增多。香煙中含有尼古丁、可尼丁、苯并芘、一氧化碳、鎘等有害物質不僅影響睪丸Leydig細胞睪酮合成及分泌，更能直接導致精子DNA鏈斷裂導致精子損傷[2-7]。精子DNA碎片化的發生信號調控機制尚不完全明了，但目前研究提示，精子發生過程中染色質組裝異常、有害刺激因素誘導的過度氧化應激、異常凋亡等多種機制參與、協同作用導致了精子DNA完整性損傷[2]。

（一）精子染色質組裝異常

精子與體細胞的核蛋白（主要是組蛋白）不同，成熟精子的核蛋白主要為魚精蛋白（富含精氨酸和半胱氨酸的堿性蛋白）。在精子發生周期中期，存在組蛋白被魚精蛋白替換機制，這一機制是一把“雙刃劍”，一方面，有利之處在于精子細胞核凝集程度大大增加，形成精子DNA超螺旋結構，達到高度濃縮、凝集的特殊結構形式，而能保持較強穿透卵子透明帶的能力；但另一方面，這一過程也降低了其本身應對內外環境損傷的修復能力。易被來自內外環境的各種有害因素所干擾，DNA雙鏈超螺旋折疊壓縮過程中產生的扭曲應力修復異常，導致精子DNA碎片化及染色質結構損傷。組蛋白向魚精蛋白轉化異常將會損傷精子DNA完整性，干擾生精過程及受精后胚胎早期發育[2,8,9]。

（二）氧化應激

精子正常代謝形成多種氧化產物（活性氧類物質，ROS），同時，機體存在抗氧化系統，氧化系統和抗氧化系統之間能夠保持動態平衡，使得機體到達“穩態”。適當水平的ROS有助于精子獲能和頂體反應。當ROS大量存在，超過了抗氧化系統的清除能力和精核獨特緊密結構的防御能力時，導致精子DNA產生單鏈或雙鏈的斷裂，造成精子DNA損傷。而且，由于精子膜含有高濃度的不飽和脂肪酸、低濃度的ROS清除酶，在過量ROS的攻擊下易發生脂類過氧化反應。使脂肪酸失去雙鍵（這些雙鍵對于維持精子膜的流動性又是必不可少的），進而精子膜失去流動性，最后導致DNA變異或斷裂。研究顯示精子暴露在外源性ROS時，DNA斷裂明顯增加，導致無堿基位點、缺失、DNA交聯及重排等[10]。精索靜脈曲張、類固醇激素、霧霾、吸煙等都可能通過誘導氧化應激導致精子DNA損傷[9,10]。

（三）凋亡機制異常

凋亡即細胞程序性死亡，是真核生物有核細胞的一種主動性生理過程，是由體內外因素觸發細胞內預存程序而導致的細胞生理性主動死亡過程。凋亡機制是機體的“清道夫”，能將損傷的細胞器及外來有害物質主動清除，維持細胞代謝穩態。精子細胞表面表達凋亡蛋白Fas，Fas/FasL信號途徑可能調控精子凋亡。研究發現不育男性精子表面Fas蛋白表達增加，提示精子未能啟動正常的凋亡以清除DNA受損的精子，導致精子DNA損傷進一步加劇[11]。凋亡會啟動內源性凋亡激酶及核酸酶的級聯反應，這些信號級聯調控發生異常，會導致精子啟動凋亡程序異常，進而導致DNA損傷[11]。但對于凋亡機制與DNA損傷的因果關聯，尚需分子生物學水平的詳細解析。

二、精子DNA損傷檢測方法

目前尚缺乏規范和統一的方法和標準，現有的各種DNA損傷的檢測方法各有利弊。常用的精子DNA損傷檢測方法包括精子染色質結構分析試驗（SCSA）、彗星實驗（Comet assay）、末端轉移酶介導的dUTP末端標記法（TUNEL）、精子染色質擴散試驗（SCD）、熒光原位雜交（FISH）、原位缺口平移法（ISNT）以及和聚合酶鏈式反應（PCR）等。SCSA反映了不同精子染色質構象結構的異質性，該方法快速、簡便，但檢測精子標本量的需求較大，需要使用流式細胞儀。Comet分析試驗是在精子細胞水平檢測DNA損傷的方法，可直接對單個精子單雙鏈的斷裂損傷進行定量，所需精子數量少，靈敏度高，但操作復雜。TUNEL法運用分子生物學及免疫組化相結合檢測凋亡精子的DNA片段，能用于細胞凋亡的研究，但操作較為復雜。SCD法簡單、快捷、但目前還難以實現自動化檢測。FISH用已知的熒光標記核酸探針與處理后待測的精子染色體進行雜交，檢測精子染色體異常及非整倍體率的分析，方法簡便，特異度高。PCR能更精細地研究精子DNA的完整性是否缺失、點突變等[12-14]。這些檢測方法之間有較好的相關性，但在檢測內容方面尚存在某些差異性。

三、精子DNA完整性檢測與SA的比較

SA（精子濃度、活動率和形態學）的指標只能反映最基本的精液質量，各參數波動范圍較大，從形態和數量方面進行分析，而對精子功能和受精能力方面提供的信息有限。因此，常規SA并不能完全反映精子是否具有正常的受精能力，也不能很好地預測精子的受精潛能。與SA比較，DNA損傷性檢測的變異系數更低：同一患者兩周內連續2次標本中精子DNA損傷的變異系數明顯低于常規SA（精子濃度、精子活動率），且同一份標本重復測定精子DNA完整性的變異系數較小。在預測男性生育能力方面，精子DNA損傷分析可能是比傳統常規SA參數更穩定、更敏感。 更有研究認為精子染色質或DNA完整性可能是精子質量的獨立預測指標，作為精子質量臨床評價標準具有優越的可行性[12-14]。DNA碎片與精子濃度沒有關聯，即SA大致正常的患者其精子DNA碎片化指數（DFI）也可能很高。Moskovtsev等[15]研究結果表明，精子DNA損傷與精子濃度、活動率、正常形態率呈顯著負相關。在精子形態學的指標中，精子形態異常與DNA斷裂有關，尤其精子頭異常與DNA損傷有顯著相關性[16,17]。可見，對于男性不育患者，除了SA之外，精子DNA檢出對預測其精子質量提供了分子生物學層面的依據。

四、精子DNA完整性檢測在體內受精中的預測作用

體內受精包括自然受孕和宮腔內人工受精（IUI）。男方精子DNA損傷率超過30%，夫婦自然受精率很低。而且當精子DNA損傷率高于30%時（SCSA法），自然妊娠率和宮腔內人工授精的妊娠率幾乎為零[18-20]。Duran等[20]通過TUNEL法研究發現，IUI時精子的DFI＞l2% 的配偶均未獲得妊娠。故認為，檢測精子DFI水平可預測IUI的成功率。對于IUI反復失敗患者，應檢測DNA碎片化程度，并針對相關因素進行干預以提高精子DNA完整性，或改行IVF及ICSI。

五、精子DNA損傷在體外受精中的預測價值

精子DNA損傷與體外受精受孕率和胚胎質量呈負相關，通過精子DNA碎片可預測IVF的成功率[21]。Henkel等報道，即使精子DFI沒有影響到受精率和體外培養胚胎碎片發生率，但當TUNEL陽性（＞36.5%）時IVF患者的妊娠率仍很低[22]。相關研究對初次行IVF或ICSI的622對夫婦精液樣本采用SCD法測定精子DNA斷裂水平，結果也發現精子DNA斷裂率與受精率呈負相關，并指出其閾值為18%，胚胎質量與精子DNA損傷有關，但臨床妊娠及分娩率與DNA損傷之間并沒有相關性[23]。國內的研究結果提示DNA碎片率與IVF受精率和優質胚胎率均存在顯著負相關[24]。但是，也有相反的意見，Borini等利用TUNEL法檢測IVF及ICSI患者的精子DNA損傷，并探討精子DNA損傷與IVF及ICSI結局的關系，發現IVF患者的臨床妊娠率與精子DNA損傷亦無顯著相關性，而ICSI患者的臨床妊娠率與精子DNA損傷呈顯著正相關[25]。另外研究發現精子DNA斷裂率與常規IVF受精率無關，而僅與ICSI受精率呈負相關，可能是因為用于ICSI的精子繞過了精卵自然選擇過程，有可能將DNA斷裂水平高的精子注入卵子有關，其結果可進一步影響ICSI后的胚胎質量和臨床妊娠率[26]。但目前精子DNA完整性對IVF技術受孕率的影響尚有爭議。

六、精子DNA損傷與妊娠結局及子代健康的關聯

隨著精子DNA損傷程度的增加，可能會發生受精后的妊娠丟失，如臨床上某些常見的反復原因不明的妊娠丟失或不良妊娠結局。持反對意見的學者認為不同DFI水平與IVF、ICSI受精率、優胚率、妊娠率均無關，但與自然流產率有關[27]。Muriel等對85例需體外受精-胚胎移植（IVF-ET）、ICSI助孕的不孕癥患者，采用SCD法檢測精子DNA損傷，探討精子DNA損傷與ART結局，結果發現DNA斷裂率越高，受精卵原核核仁前體發育不同步性也隨之增高；DNA斷裂高水平組胚胎發育速度緩慢并且形態異常的比例高；但IVF妊娠組與非妊娠組的SCD結果差異無統計學意義（P＞0.05），考慮與受精以及植入前的胚胎自然選擇過程有關[28]。文獻報道接受ICSI治療的患者，其后代染色體異常的比例（1.6%）高于正常受精后分娩的嬰兒（0.5%），出生缺陷的風險亦高于正常人群[29]。應用DNA損傷嚴重的精子時，胚胎可以植入宮內并繼續發育，也可能會發生胚胎發育中斷或自然流產。即使當精子DNA損傷程度較輕時，胎兒發育也可能受影響，甚至導致子代先天畸形。 關于精子DNA損傷與IVF/ISCI術后妊娠丟失相關的系統評價及Meta分析指出[27]：精子DNA損傷對子代健康產生不良影響，會導致子代壽命減短，行為異常增加、病理情況顯著增加、后代癌癥罹患率增高、顯性基因突變增加。因此，在進行ICSI前，對精子DNA進行評估十分必要。英國生殖醫學會的推薦指南：精子質量差能干擾助孕技術成功率，建議助孕周期過程中進行精子DNA損傷的檢測。

七、精子DNA檢測的局限性

目前對于精子DNA損傷的機制及對生育結局的影響還存在眾多未解之謎，觀點上也存在爭論，其局限性包括目前尚未能真正建立有效的臨床應用體系，因為眾多支持性研究都是小樣本的，并且研究類型各異，證據不足。實驗室人員目前還缺乏有效培訓，很多檢測方法還不能臨床常規性應用。目前精子DNA檢測并不能提供特異性的DNA序列預測，或許是其短板所在。另外，有觀點認為，即使能夠檢測出精子細胞核內存在DNA碎片，那又能如何? 因為目前尚無特效治療及預防精子DNA碎片化產生的方法。因此，有學者認為如果是僅僅檢測及確定精子DNA碎片而卻“束手無策”，就沒必要浪費人力及物力去開展。但也有研究發現相應的對癥治療如藥物抗氧化、必需微量元素補充、糾正吸煙等不良生活方式等，對于減低及恢復精子DNA碎片化、改善妊娠結局還是有益的[30]。

綜上所述，隨著ART的發展，由于其局限性，單純傳統的SA分析已不能滿足需要，急需新的檢測方法來預測精子的受精能力及對胚胎的影響。精子DNA損傷程度檢測有望成為一個新的評價精液質量和預測生育能力的指標，但對精子DNA損傷的病因、機制、預防及干預尚存在眾多未解之謎，方法學上也有待于建立行之有效的臨床標準體系，制定適合國人的檢測標準值，在臨床應用方面仍需繼續深入研究。

致謝：本課題受北京市自然科學基金面上項目（7142158）資助

精子; DNA損傷; 受精

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（2014-03-03收稿）

10.3969/j.issn.1008-0848.2014.07.017

R 321.1