精卵孵育過程中活性氧對體外受精-胚胎移植結局的影響*

張 娜張 軼張耀恒趙世彬乜照燕甄秀麗李亞麗

1. 河北醫科大學第四醫院（石家莊 050011）;

2. 五礦邯邢礦山局職工總醫院；3. 河北省人民醫院

精卵孵育過程中活性氧對體外受精-胚胎移植結局的影響*

張 娜1**張 軼1張耀恒2趙世彬1乜照燕1甄秀麗1李亞麗3

1. 河北醫科大學第四醫院（石家莊 050011）;

2. 五礦邯邢礦山局職工總醫院；3. 河北省人民醫院

目的通過檢測洗精培養液和受精培養液中活性氧的關系，探討精卵孵育不同時間對體外受精-胚胎移植（IVF-ET）結局的影響。方法接受常規體外受精（IVF）受精的夫婦161例，精液經處理后留取標本（即洗精培養液）3份，分別定為加精后0h、5h和20h檢測過氧化氫（H2O2）、過氧化氫酶（CTA）。每名患者取出的卵冠丘復合物（OCCCs）隨機分為兩組：A組為短時受精，B組為長時受精，檢測移卵后的受精培養液中H2O2、CTA的含量。移植的123名患者隨機分成兩組，一組62人選擇短時受精的胚胎進行移植，另一組61人選擇長時受精的胚胎進行移植。結果H2O2及CTA水平在授精后5h明顯與A組呈正相關（r值分別為0.477和0.518，P＜0.05），在授精后20h與B組呈明顯正相關（r值分別為0.681和0.868，P＜0.05）。授精后5h及授精后20h的洗精培養液中H2O2水平均明顯高于相應時間的受精培養液（P＜0.05），而CTA水平只在授精后5h明顯低于A組的受精培養液（P＜0.05），在授精后20h與B組之間沒有明顯差異（P＞0.05）。B組的多精受精率明顯高于A組（P＜0.05），A組的優胚率明顯高于B組（P＜0.05），兩組間的受精率、卵裂率、植入率、臨床妊娠率無統計學差異。結論 縮短精卵孵育時間可以使卵子盡早脫離高活性氧的環境，有利于胚胎的發育。

體外受精; 胚胎移植; 活性氧

在體外受精（IVF）中精卵結合并孵育是一個復雜而重要的過程。受精情況以及胚胎質量直接關系到體外受精-胚胎移植（in vitro fertilization and embryo transfer, IVF-ET）治療的結果。傳統的操作過程是將卵子和精子共培養16～18h，稱為長時受精或過夜培養。這種受精方式能保證卵子有足夠的時間受精，從而獲得良好的受精率。然而成熟卵的受精過程在精卵相遇的2～4h內便可完成。因此，長時受精與短時受精的利弊近年來逐漸成為生殖醫學的研究熱點。本研究通過分析精液處理后不同時間洗精液中以及長、短時受精受精液中活性氧的相關性，對比長時受精與短時受精兩種精卵孵育時間的實驗室參數及臨床結局，探討精卵孵育不同時間對體外IVF-ET結局的影響。

材料與方法

一、研究對象

2010年11月至2012年12月于我院生殖醫學科接受常規IVF助孕的夫婦161例，男性既往檢查精液各參數正常，排除白細胞精液癥，排除外傷及遺傳性疾病家族史，排除性功能障礙病史，體檢未發現有明顯睪丸、附睪及輸精管異常。女性年齡≤36歲，排除結核、子宮內膜異位癥及宮腔病變，獲卵數8～15個。共取卵161個周期，移植123個周期。

二、洗精培養液的標本收集

在取卵當日手淫法采集精液，全部精液以Pure Sperm梯度離心法進行精液處理。于處理后將精子濃度調整為10×106/mL，留取標本（即洗精培養液）3份，每份1.0mL。第一份標本定為加精后0h（即在CO2培養箱內培養至該患者卵子加精時）檢測，第二份標本定為加精后5h（即在CO2培養箱內培養至該患者卵子加精后5h后）檢測，第三份標本定為加精后20h（即在CO2培養箱內培養至該患者卵子加精后20h后）檢測，每份標本均用于檢測過氧化氫（Hydrogen peroxide, H2O2）、過氧化氫酶（Catalase, CTA）的含量。

三、受精方法、分組、胚胎培養

每名患者取出的卵-冠-丘復合物（Oocyte corona cumulus complexes，OCCCs）隨機分為兩組：A組為短時受精，精卵共孵育5h后，將卵子轉移至新鮮的受精培養液中。B組為長時受精，精卵共孵育過夜。兩組均在OCCC取出后2～4h按精卵20 000～50 000:1的比例混合進行授精。授精后18～20h去掉卵子周圍的顆粒細胞，清洗后轉入卵裂培養基中，倒置顯微鏡下觀察受精情況。見到原核（PN）形成即為受精，見2PN為正常受精，見＞2PN為多精受精。取卵后48h、72h觀察胚胎發育情況，進行胚胎質量評分[1]。優質胚胎標準：取卵后72h胚胎細胞總數≥6且≤12個，卵裂球大小均勻或略不均勻，碎片≤20%。

四、受精培養液的標本收集

將轉移卵子之后的受精液體（短時受精為5h，長時受精為20h）吸取到試管中，然后500×g，離心20min，吸取上清液，得到約1mL的受精培養液標本，用來檢測H2O2、CTA的含量。

五、H2O2及CTA的含量測定

采用分光光度比色測定法進行測定。每份標本離心后取上清液，按試劑盒說明書操作，用分光光度計讀取吸光度值。

六、胚胎移植、黃體支持及妊娠判斷

取卵后72h為移植日，除外取消移植的患者38名，其余的123名患者隨機分成兩組，一組62人選擇短時受精的胚胎進行移植，另外一組61人選擇長時受精的胚胎進行移植。取卵日開始每日肌注黃體酮60mg支持黃體。胚胎移植后14d尿妊娠試驗或血β-HCG確定生化妊娠，移植后28d B超見孕囊診斷臨床妊娠。

七、統計學方法

結 果

一、授精后不同時間的洗精培養液中與兩組受精培養液中活性氧之間的關系

無論是授精后5h，還是授精后20h，洗精培養液中H2O2水平均明顯高于相應時間的受精培養液（P＜0.05），而CTA水平只在授精后5h明顯低于短時受精的洗精培養液（P＜0.05），在授精后20h與長時受精之間沒有明顯差異（P＞0.05）。H2O2及CTA水平在授精后5h明顯與短時受精呈正相關（r值分別為0.477和0.518,P＜0.05）；授精后20h的H2O2及CTA水平亦與長時受精呈明顯正相關（r值分別為0.681和0.868,P＜0.05）。結果見表1、表2、表3。

受精率=受精卵子數/獲得卵子數；多精受精率=多精受精卵子數/獲得卵子數；卵裂率=形成胚胎數/受精卵子數；優胚率=優質胚胎數/2PN卵子數，植入率=種植胚胎數/移植胚胎數，臨床妊娠率=臨床妊娠周期數/移植周期數。B組的多精受精率明顯高于A組（P＜0.05），A組的優胚率明顯高于B組（P＜0.05），兩組間的受精率、卵裂率、植入率、臨床妊娠率無統計學差異，結果見表4。

表1 授精后5h洗精培養液中與短時受精受精培養液中活性氧之間的比較（n=161,x±s）

表1 授精后5h洗精培養液中與短時受精受精培養液中活性氧之間的比較（n=161,x±s）

與A組相比，P＜0.05

H2O2(mmol/L) CTA(U/mL) A 11.46±4.14 7.97±2.31 5h 22.53±5.51*5.01±1.72*t值 20.381 13.041P值 0.000 0.000*

表2 授精后20h洗精培養液中與長時受精受精培養液中活性氧之間的比較（n=161,x±s）

表2 授精后20h洗精培養液中與長時受精受精培養液中活性氧之間的比較（n=161,x±s）

與B組相比，*P＜0.05

H2O2(mmol/L) CTA(U/mL) B 24.11±15.52 1.84±0.85 20h 30.26±6.34*1.77±1.39t值 4.655 0.545P值 0.000 0.586

表3 授精后不同時間的洗精培養液中與兩組受精培養液中活性氧之間的相關性(n=161)

表4 長時受精、短時受精兩組間實驗室參數及臨床結局的比較 (%)

討 論

在傳統的體外受精操作過程中，卵子和精子共培養16～18h，為長時受精。這種受精方式能保證卵子有足夠的時間受精，而且減少對卵細胞的觀察和操作次數，也減少了卵細胞在培養箱外暴露的時間。但是有研究表明精卵孵化時間大于3h顆粒細胞可產生大量的氧化物質[2]。同時體外受精過程中高濃度精子亦會產生高水平活性氧，繼而對胚胎發育造成影響。

活性氧（Reactive oxygen species, ROS）是氧離子、自由基和過氧化物等活性物質的統稱。在生理情況下，活性氧的產生和清除保持動態平衡，機體具有使活性氧維持在細胞功能所必需的非常低的水平[3]。如果活性氧的產生速度超過了機體對其清除的能力，就使機體內活性氧產生堆積，機體則處于一種氧化應激狀態。在生殖過程中，活性氧在精子獲能、精卵受精等生理過程中發揮重要作用。本研究發現，無論是授精后5h，還是授精后20h，洗精培養液中H2O2水平均明顯高于相應時間的受精培養液，即授精后5h明顯高于短時受精的受精培養液，授精后20h明顯低于長時受精的受精培養液；而CTA水平只在授精后5h明顯低于短時受精的受精培養液。洗精培養液中H2O2水平均明顯高于受精液的原因可能有兩個：（1）精子本身可以產生活性氧，而H2O2是精子產生的主要活性氧類。受精培養液中加入的精子只有少量，原則上5 000～10 000條精子即可使一個卵子完成受精。在我們的研究中，每一個卵子加入了20 000～50 000條精子，因此，精子的濃度在洗精培養液中比在受精培養液中要高，故而產生的H2O2也會多。（2）有可能顆粒細胞能夠產生一定量的CTA，可以分解部分H2O2，CTA水平在授精后5h明顯低于短時受精的洗精培養液這一點可以解釋這一推斷。但顆粒細胞產生的CTA是有限的，隨著作用時間的延長，CTA會被消耗掉，因此，CTA在授精后20h與短時受精之間沒有明顯差異。本研究還發現，H2O2及CTA水平在授精后5h明顯與短時受精呈正相關；授精后20h的H2O2及CTA水平亦與長時受精呈明顯正相關。這一結果驗證了精子及顆粒細胞均可產生活性氧物質H2O2，并同時消耗顆粒細胞產生的CTA，因此，在長時受精過程中，卵子所處的環境具有高濃度的H2O2。高濃度的H2O2使得卵子處于氧化應激狀態，不利于卵子的受精及受精卵的分裂。

在20世紀末期，Dirnfeld等[4]發現縮短精卵共孵育時間可提高胚胎質量和種植潛能，因此國內外一些中心開始了短時受精的研究。但結果并不一致。有研究認為短時受精可以提高優質胚胎率，改善妊娠結局[5-8]。但也有報道發現短時受精并沒有這個優勢[9-11]。本研究結果顯示，長時受精組的多精受精率明顯高于短時受精組，且短時受精組的優胚率明顯高于長時受精組，兩組間的受精率、卵裂率、植入率、臨床妊娠率無統計學差異。結果與其他學者的研究有些一致，有些并不一致。這可能與各生殖中心實驗室的技術方法、精卵共孵育時所加的精子量、研究設計及病例選擇等不同有關。

綜上所述，短時受精更符合人類自然生理條件，在不影響受精率的前提下，可以降低多精受精率，提高優胚率。而長時受精使卵子暴露于較高精子濃度的受精培養液中長達十多個小時，同時使卵子長時間暴露在高濃度的活性氧環境中，最終影響卵子質量，使異常受精率增高，優質胚胎率降低，不利于IVF的結局。因此，縮短精卵孵育時間可以使卵子盡早脫離高活性氧的環境，有利于胚胎的發育。

1 莊廣倫. 現代輔助生殖技術. 北京: 人民衛生出版社, 2005: 58-59

2 Menezo Y, Barak Y. Comparison between day-2 embryos obtained either from ICSI or resulting from short insemination IVF: influence of maternal age.Hum Reprod2000; 15(8): 1776-1780

3 O'Flaherty C, de Lamirande E, Gagnon C. Positive role of reactive oxygen species in mammalian sperm capacitation: triggering and modulation of hosphorylation events.Free Radic Biol Med2006; 41(4): 528-540

4 Dirnfeld M, Bider D, Koifman M,et al. Shortened exposure of oocytes to spermatozoa improves in-vitro fertilization outcome: a prospective, randomized, controlled study.Hum Reprod1999; 14 (10): 2562-2564

5 Enkhmaa D, Kasai T, Hoshi K. Long-time exposure of mouse embryos to the sperm produces high levels of reactive oxygen species in culture medium and relates to poor embryo development.Reprod Domest Anim2009; 44(4): 634-637

6 屈宗銀, 王鳳英, 李玉艷, 等. 短時受精對體外受精結果的影響. 第三軍醫大學學報 2010; 32(16): 1785-1787

7 方偉芬, 馮貴雪, 張波, 等. 精卵孵育時間對胚胎質量的影響. 廣西醫學 2008; 30(9): 1333-1334

8 吳娟, 何晶晶, 章志國, 等. 短時IVF與傳統IVF臨床結果比較. 安徽醫科大學學報 2013; 48 (2): 189-191

9 宋小兵, 張翠蓮, 張欽憲. 不同脫顆粒細胞時間對IVFET治療周期的影響. 當代醫學 2013; 19(15): 40-41

10 Barraud-Lange V, Sifer C, Pocate K,et al. Short gamete coincubation during in vitro fertilization decreases the fertilization rate and does not improve embryo quality: a prospective auto controlled study.J Assist Reprod Genet2008; 25(7): 305-310

11 乜照燕, 吳海峰, 甄秀麗, 等. 短時受精聯合早期補救性卵胞質內單精子注射在重度畸形精子癥患者中的臨床應用. 中國男科學雜志 2014; 28(1): 29-33

（2014-01-20收稿）

Impact of ROS on the outcome of in vitro fertilization and embryo transfer in the incubation of oocytes and sperm*

Zhang Na1**,Zhang Yi1, Zhang Yaoheng2, Zhao Shibin1, Nie Zhaoyan1, Zhen Xiuli1, Li Yali3
1. The Fourth Hospital of Hebei Medical University, ShiJiaZhuang 050011, China; 2. Minmetals Hanxing Mine Bureau Hospital; 3. The People Hospital of HeBei Province

Zhang Na, E-mail: Email: 13833116806@163.com; Tel: 13833116806

Objective To analyze the relationship of reactive oxygen species between the sperm wash medium and insemination medium, and explore the effect of different incubation time on the outcome of in vitro fertilization and embryo transfer.MethodsOne hundred and sixty-one patients who underwent in vitro fertilization and embryo transfer for female infertility were recruited in the study. Three samples were collected after the semen of patients was pretreated with Pure Sperm. Each was def ned as 0h after insemination, 5h after insemination and 20h after insemination to detect of the content of H2O2and CTA. On the oocyte retrieval day, the OCCCs which retrieved from the same patient were divided into short-term fertilization group (group A) and long-term fertilization group (group B) according to incubation time. The concentrations of H2O2and CTA in insemination medium were detected respectively. On the embryo transfer day,the patients were divided into two groups: one group of patients chose short-term fertilized embryo to transfer, one group of patients chose long fertilized embryo to transfer.ResultsThe levels of hydrogen peroxide and catalase at 5h after insemination were positively correlated with those of group A(r=0.477, 0.518,P<0.05), and the levels of hydrogen peroxide and catalase at 20h after insemination were positively correlated with those of group B(r=0.681, 0.868,P<0.05). The levels of hydrogen peroxide at 5h, 20h after insemination were corresponding higher than that in the insemination medium of group A and group B signif cantly (P<0.05). The levels of catalase at 5h after insemination were lower than those in the insemination medium of group A signif cantly (P<0.05), but the levels of catalase at 20h after insemination had no difference with those in the insemination medium of group B(P>0.05). The polyspermy rate in group B was signif cantly higher than that in group A(P<0.05), and the high quality embryo rate in group A was signif cantly higher than that in group B(P<0.05). There were signif cant difference in fertilization rate, cleavage rate, implantation rate, clinical pregnancy rate between the two groups (P>0.05).ConclusionShorten the incubation time of oocytes and spermcould protect oocytes from the high reactive oxygen environment so as to improve the quality of embryos.

in vitrofertilization ; embryo transfer; reactive oxygen species

10.3969/j.issn.1008-0848.2014.07.010

R 321-33

資助: 河北省衛生廳重點科技研究計劃（編號：20110144）
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