從細(xì)胞角度理解特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化的發(fā)病機(jī)制

朱 毅

特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis, IPF)是一種后果嚴(yán)重但病因不明的疾病。目前已知有大量的細(xì)胞因子、細(xì)胞信號通路參與其發(fā)病機(jī)制。但是，由于細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)之間錯綜復(fù)雜的相互作用，使得IPF發(fā)病機(jī)制顯得極其繁雜[1]。而伴隨新的細(xì)胞因子和信號通路的不斷被發(fā)現(xiàn)，又將對這一問題的認(rèn)識更趨紛繁無序。然而，相對無數(shù)的細(xì)胞因子和炎癥反應(yīng)通路來說，肺部的細(xì)胞成分是有限的，異常的始動環(huán)節(jié)很可能發(fā)生在其中的一種或兩種細(xì)胞之中。因此，著眼于IPF中關(guān)鍵細(xì)胞成分，了解其發(fā)病機(jī)制，不失為學(xué)習(xí)和研究IPF機(jī)制的新角度。

一、上皮細(xì)胞

1. 上皮細(xì)胞的凋亡： 形態(tài)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，在IPF的發(fā)病過程中，上皮細(xì)胞逐漸減少。該現(xiàn)象是因?yàn)樵贗PF患者中，Ⅰ型和Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞都發(fā)生著不同程度的損傷[2]。電鏡下可見Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞存在凋亡改變。甚至在多數(shù)看似“正常”的肺泡上皮細(xì)胞，其Ⅱ型上皮也已經(jīng)發(fā)生著活躍的程序性細(xì)胞死亡現(xiàn)象[3]。對IPF患者上皮細(xì)胞凋亡現(xiàn)象的解釋包括Fas信號通路活躍、氧化應(yīng)激過度、主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex, MHC)[2]多態(tài)性和端粒酶陰性表達(dá)等。例如在IPF患者的肺泡上皮細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)Fas信號通路活躍的現(xiàn)象。帶有死亡區(qū)域的Fas相關(guān)蛋白(FADD)與表達(dá)增高的Fas相互作用，激活caspase 8，導(dǎo)致凋亡[4]。在Fas介導(dǎo)的凋亡過程中，轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)扮演著促進(jìn)者的角色[5]。又例如還原型輔酶Ⅱ(NADPH)氧化酶(NOX4)在IPF患者的肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞中存在高表達(dá)。NOX4基因敲除的小鼠，其肺上皮細(xì)胞在TGF-β作用后，不產(chǎn)生反應(yīng)氧(reactive oxygen species, ROS)，不發(fā)生凋亡。因此氧化應(yīng)激在IPF的上皮細(xì)胞凋亡中也可能具有重要意義[6]。MHC多態(tài)性可能通過凋亡機(jī)制決定著IPF的易感性[7]。IPF患者未受影響的肺組織與正常肺組織相比，盡管IPF患者擁有相同數(shù)量的肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞，但這些細(xì)胞大多為端粒酶陰性，因而凋亡率增高[8]。

2.上皮細(xì)胞向間質(zhì)成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT): 形態(tài)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，在IPF的發(fā)病過程中，上皮細(xì)胞數(shù)量逐漸減少而間質(zhì)中成纖維細(xì)胞數(shù)量逐漸增多。有趣的是，上皮凋亡最顯著的部位附近，成纖維細(xì)胞的增生也最為顯著[9]。這兩種空間分布上密切相關(guān)的現(xiàn)象，提示部分成纖維細(xì)胞可能來自于轉(zhuǎn)化的上皮細(xì)胞。即在部分Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞活躍凋亡的同時，另一些Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞也發(fā)生著增殖，增殖的上皮細(xì)胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)化并向間質(zhì)轉(zhuǎn)移，成為間質(zhì)成纖維細(xì)胞的重要來源，即EMT[10]。如果將IPF的病變分為三個區(qū)域：鄰近纖維化的區(qū)域、具有明顯正常肺泡結(jié)構(gòu)的區(qū)域和中間形態(tài)區(qū)域，并且用TF抗體著色Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞的游離面，進(jìn)行肺泡上皮細(xì)胞計數(shù)，就可發(fā)現(xiàn)離纖維化區(qū)域越近，Ⅱ型肺泡上皮的數(shù)量越多[11]，而且這些增生的Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞在表型上已經(jīng)逐漸向成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化。例如從IPF患者分離到的肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞表達(dá)更高水平的Ⅰ型膠原，α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)和類肌鈣蛋白(calponin)[12]。雙重免疫組織化學(xué)顯示，IPF患者的這些上皮細(xì)胞同時具有上皮和間質(zhì)的標(biāo)記[13]。正因?yàn)樵洁徑w維化區(qū)域，就有越多的Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為間質(zhì)細(xì)胞，所以間質(zhì)纖維化并非源于成纖維細(xì)胞的異常，而是可以追溯到Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞具有異質(zhì)性的凋亡-增殖行為。EMT發(fā)生的促進(jìn)因素有很多，如TGF-β1，自由基等[14]。但TGF-β1的作用無疑是最受到重視的。體外研究表明，TGF-β1作用于上皮細(xì)胞可發(fā)生表型轉(zhuǎn)化，類似成纖維細(xì)胞[15]。而拮抗TGF-β1以阻止EMT的研究也正在進(jìn)行。

3. 上皮細(xì)胞與TGF-β及纖維化相關(guān)細(xì)胞因子: TGF-β在IPF的纖維化機(jī)制中具有中心地位，同時在上皮細(xì)胞凋亡和EMT過程中也具有關(guān)鍵作用。有研究者比較了IPF患者與對照患者的細(xì)胞因子表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)在研究的17種細(xì)胞因子中，IPF患者僅有TGF-β和IL-10是顯著高于對照組，說明TGF-β1和IL-10在IPF的發(fā)病機(jī)制中可能是不可或缺的。如果TGF-β的效應(yīng)缺失，例如特異性地在上皮細(xì)胞中敲除TGF-β Ⅱ型受體，可保護(hù)小鼠不受博萊霉素誘導(dǎo)的纖維化影響[16]。目前發(fā)現(xiàn)，IPF患者中增生的肺泡上皮細(xì)胞是TGF-β的主要來源[17]，尤其是蜂窩處的被覆上皮細(xì)胞，更是具有活性的TGF-β1的主要來源，因此凸顯出上皮細(xì)胞對于TGF-β1生成的重要作用。IPF患者的Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞還表達(dá)結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor, CTGF)，一種轉(zhuǎn)錄受到TGF-β的調(diào)控的生長因子和趨化因子[18]；趨化因子(C-X-C基序)配體-12 (chemokine (C-X-C motif) ligand 12, CXCL12)，在肺泡上皮內(nèi)也有高表達(dá)。CXCL12可以趨化纖維細(xì)胞(fibrotic cell)至肺內(nèi)，使之轉(zhuǎn)變?yōu)槌衫w維細(xì)胞或肌成纖維細(xì)胞[19]。

4. 上皮細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激: 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress, ER stress)不是IPF的始動因素。它是一個在已知和未知的始動因素之后發(fā)生的重要現(xiàn)象，這個現(xiàn)象也許可以解釋復(fù)雜的細(xì)胞生物學(xué)行為和處于下游的細(xì)胞因子級聯(lián)反應(yīng)。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激普遍存在于人類疾病中。干擾內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能的因素(如低氧、營養(yǎng)缺乏、病毒感染)可使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中非折疊蛋白質(zhì)堆積，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。強(qiáng)烈的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可導(dǎo)致細(xì)胞(包括上皮細(xì)胞)凋亡[20]，同時ER應(yīng)激減少了上皮細(xì)胞的標(biāo)記，增加了肌成纖維細(xì)胞的標(biāo)記，促進(jìn)了EMT的形成。已證明在IPF患者的肺泡上皮細(xì)胞中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和未折疊蛋白的激活(unfolded protein response，UPR)是常見的現(xiàn)象。雖然IPF中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的原因還不清楚，但皰疹病毒感染、吸入顆粒、吸煙都是可能的因素。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激似乎較上述細(xì)胞凋亡、EMT等現(xiàn)象更接近IPF發(fā)病機(jī)制的上游環(huán)節(jié)，但始動因素仍不清楚[21]。

5. 上皮細(xì)胞與病毒感染: 上皮細(xì)胞的凋亡、EMT、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、TGF-β的生成均為上皮細(xì)胞的重要現(xiàn)象，但I(xiàn)PF的始動因素仍是一個謎。博萊霉素導(dǎo)致的肺纖維化，或者單一細(xì)胞因子在肺纖維化中的作用，顯然并非人類IPF的發(fā)病機(jī)制。目前僅有病毒感染能模擬從病因到表現(xiàn)的完整IPF發(fā)病過程。

動物實(shí)驗(yàn)表明，皰疹病毒感染可誘導(dǎo)或加重肺纖維化[22]。病毒性上皮損傷不僅可導(dǎo)致凋亡，還可導(dǎo)致EMT。比如慢性皰疹病毒MHV68感染鼠類肺上皮細(xì)胞可誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化生長因子TWIST表達(dá)，并在上皮細(xì)胞表達(dá)間質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記。抑制TWIST可保持上皮表型。有趣的是IPF患者的肺泡上皮細(xì)胞TWIST亦呈強(qiáng)陽性表達(dá)，這些TWIST陽性細(xì)胞還具有EMT特征，如E-鈣黏附素(E-cadherin)減少，間質(zhì)標(biāo)記物如N-黏附素(N-cadherin)上調(diào)。更重要的是，若IPF肺組織存在高水平的TWIST蛋白表達(dá)，則與EBV和皰疹病毒的檢出具有相關(guān)性[23]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，EBV表達(dá)的潛伏膜蛋白-1(latent membrane protein-1, LMP-1)可使上皮細(xì)胞表達(dá)很多的基質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物，同時上皮標(biāo)記減少。IPF患者只要有LMP-1染色陽性(肺上皮)，進(jìn)展就較陰性者快[24]。這種進(jìn)展的機(jī)制可能與EBV誘導(dǎo)TGF-β1的表達(dá)有關(guān)[25]。抗病毒治療有望從這些環(huán)節(jié)抑制疾病的進(jìn)展。

二、 成纖維細(xì)胞

1. 成纖維細(xì)胞的來源: 肌成纖維細(xì)胞的來源很多，包括固有的間質(zhì)細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、循環(huán)中的纖維細(xì)胞(fibrocyte)。IPF中，除上皮細(xì)胞發(fā)生EMT以外，纖維細(xì)胞是肺部成纖維細(xì)胞的潛在來源之一。纖維細(xì)胞是成纖維細(xì)胞在血循環(huán)中的前體細(xì)胞。用免疫熒光和激光共聚焦的方法，發(fā)現(xiàn)IPF患者肺組織中存在纖維細(xì)胞而正常肺組織中未發(fā)現(xiàn)纖維細(xì)胞，纖維細(xì)胞與IPF成纖維細(xì)胞灶的數(shù)量之間呈正相關(guān)關(guān)系[19]。

2. IPF成纖維細(xì)胞具有抗凋亡特性: IPF肺內(nèi)的成纖維細(xì)胞具有抗凋亡的特性。機(jī)制包括內(nèi)皮素-1(edothelin-1, ET-1)表達(dá)增加、TGF-β1、Fas表達(dá)下降、Rho/ROCK激酶通路的活化和細(xì)胞機(jī)械敏感性信號通路等。

人類IPF患者的肺組織ET-1的表達(dá)增加。ET-1可誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞的增值、分化、收縮和膠原合成[26]。ET-1和TGF-β1一樣，可通過活化AKT獨(dú)立地誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞對凋亡的抵抗。IPF患者的成纖維細(xì)胞其Fas表達(dá)下調(diào)，不利于凋亡的發(fā)生。而且與正常對照的成纖維細(xì)胞相比，IPF患者的成纖維細(xì)胞對FasL誘導(dǎo)的凋亡具有抗性。該能力是獲得性的，它至少受到兩種蛋白激酶的調(diào)節(jié)，一為fak，二為pkb。因此導(dǎo)入Fas是治療IPF的思路之一，同樣針對蛋白激酶fak和pkb的治療，也可能在肺纖維化治療方面具有價值[27-28]。肌成纖維細(xì)胞中存在Rho/Rho kinase(Rho/ROCK)激酶通路的活化。使用ROCK抑制劑阻斷該通路可誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞的凋亡，機(jī)制可能是下調(diào)Bcl-2，和活化內(nèi)源性線粒體凋亡通路。在后炎癥時期使用法舒地爾或用基因手段敲除MKL1可保護(hù)實(shí)驗(yàn)動物不發(fā)生肺纖維化。提示針對成纖維細(xì)胞機(jī)械敏感性(mechanosensitive)信號通路可觸發(fā)內(nèi)源性凋亡，且有一定的治療價值[29]。

3. 成纖維細(xì)胞的活化和增殖: 目前對成纖維細(xì)胞活化和增殖的研究都發(fā)現(xiàn)其涉及的細(xì)胞因子或通路與TGF-β有關(guān)。具有代表性的是miR-21、Thy-1和AR。

在IPF患者中，肌成纖維細(xì)胞存在miR-21的上調(diào)。miR-21介導(dǎo)了成纖維細(xì)胞的活化，阻斷miR-21可使小鼠肺纖維化減輕[30]。IPF患者的成纖維細(xì)胞的Thy-1是陰性的，而正常人的成纖維細(xì)胞的Thy-1是陽性的。Thy-1陰性的成纖維細(xì)胞具有基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinases-9，MMP-9)蛋白的高表達(dá)，體積更小，增生更旺盛，更易被TGF-β1誘導(dǎo)生成I型膠原[31]。MMP-9的表達(dá)可被Thy-1陽性表達(dá)所逆轉(zhuǎn)，也可被TGF-β1受體拮抗劑逆轉(zhuǎn)[32]。兩棲調(diào)節(jié)素(amphiregulin, AR)是表皮生長因子受體(epithelial growth factor receptor, EGFR)的配體，對成纖維細(xì)胞具有劑量依賴性的刺激作用。無論實(shí)驗(yàn)動物還是IPF患者中都發(fā)現(xiàn)了AR表達(dá)失調(diào)和EGFR活化的現(xiàn)象。TGF-β1可明顯誘導(dǎo)AR在肺成纖維細(xì)胞中的表達(dá)。如果用iRNA或吉非替尼抑制AR，則可顯著抑制TGF-β1對成纖維細(xì)胞的刺激作用，也可抑制其它肺纖維化的相關(guān)現(xiàn)象。所以AR，或AR激活的EGFR信號通路，是IPF治療有希望的靶點(diǎn)[33]。

4. ANG-TGF-β1的內(nèi)分泌循環(huán): 從IPF患者提取的肌成纖維細(xì)胞，組成型表達(dá)血管緊張素Ⅱ(angiotensin-Ⅱ, ANG-Ⅱ)的前體，即血管緊張素原(angiotensinogen，AGT)。與正常人體成纖維細(xì)胞相比，IPF患者的成纖維細(xì)胞組成型表達(dá)更多的AGT和TGF-β1的mRNA，并釋放更多的AGT蛋白、ANGⅡ和活化的TGF-β1蛋白。用ANGⅡ的拮抗劑saralasin處理IPF患者的成纖維細(xì)胞，可減少TGF-β1的表達(dá)，說明AGT對TGF-β1有促生成作用；而TGF-β1也可增加AGT的mRNA的表達(dá)。抗TGF-β1的反義核苷酸或TGF-β1的抗體可明顯減少AGT的表達(dá)。此現(xiàn)象支持血管緊張素/TGF-β1存在內(nèi)分泌循環(huán)，并可以解釋ACEI和ANG受體拮抗劑為什么可抑制實(shí)驗(yàn)動物的肺纖維化[34]。

三、 其他細(xì)胞(內(nèi)皮細(xì)胞、間皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞)

1. 內(nèi)皮細(xì)胞: 所有IPF患者都存在微血管內(nèi)皮損傷的形態(tài)學(xué)依據(jù)。包括內(nèi)皮細(xì)胞壞死、腫脹，細(xì)胞間緊密連接縮短[2]。也存在反復(fù)的微血管損傷的依據(jù)，如基底膜膠原沉積和片層化。內(nèi)皮細(xì)胞的損傷與體液機(jī)制有關(guān)。直接免疫熒光顯示有IgG、IgM和IgA沉積。血清學(xué)檢查顯示對多種內(nèi)皮細(xì)胞抗原具有免疫反應(yīng)[35]。內(nèi)皮細(xì)胞損傷以后可產(chǎn)生致纖維化因子、促增殖因子和趨化因子，這些現(xiàn)象可能是纖維化的早期事件[9]。除了上述作用以外，毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞也可向基質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化[36]。

2. 間皮細(xì)胞: 由于IPF主要由胸膜下開始起病，如果用胸膜間皮細(xì)胞(pleural mesothelial cell, PMC)染色，可以發(fā)現(xiàn)PMC在IPF中普遍存在。但在COPD和CF中不存在。TGF-β1在動物實(shí)驗(yàn)中可使PMC出現(xiàn)在支氣管肺泡灌洗液中，并表達(dá)肌成纖維細(xì)胞標(biāo)記[37]，說明間皮細(xì)胞也是間質(zhì)中成纖維細(xì)胞的來源之一。

3. 巨噬細(xì)胞: 肺泡巨噬細(xì)胞和間質(zhì)巨噬細(xì)胞存在增生現(xiàn)象[2]。但在IPF患者的肺泡巨噬細(xì)胞內(nèi)，普遍存在基因表達(dá)下調(diào)的現(xiàn)象。與此同時，血液中的單核細(xì)胞未發(fā)現(xiàn)有此種現(xiàn)象[38]，也就是說IPF患者肺泡巨噬細(xì)胞的功能存在缺陷。特異性地辨認(rèn)和吞噬凋亡細(xì)胞是巨噬細(xì)胞的功能。胞葬作用也是調(diào)節(jié)炎癥和修復(fù)所必需的。在IPF患者的BALF中，未吞噬的凋亡細(xì)胞明顯增多[39]。

結(jié) 論

IPF曾被認(rèn)為是一個慢性炎癥導(dǎo)致的疾病，但越來越多的證據(jù)支持異常活化的肺泡上皮細(xì)胞(alveolar epithelial cells,AECs)才是發(fā)病的主要原因。因?yàn)闊o論早期還是晚期IPF病例其炎癥的程度僅為輕、中度，而強(qiáng)有力的抗炎治療對其無效。IPF患者在經(jīng)過單肺移植以后，盡管使用環(huán)孢素為主的免疫抑制方案，但原肺均仍出現(xiàn)了纖維化病變進(jìn)展。說明免疫抑制劑對IPF是無效的[40]。動物實(shí)驗(yàn)也證明了纖維化的產(chǎn)生不一定需要炎癥反應(yīng)的伴隨[41]。

肺組織的多數(shù)細(xì)胞成分都成為了研究的內(nèi)容。雖然IPF中細(xì)胞成分的結(jié)構(gòu)和功能異常出現(xiàn)在多個環(huán)節(jié)，但上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞無疑是關(guān)注的焦點(diǎn)。相比成纖維細(xì)胞，上皮細(xì)胞的重要性在于它不僅是間質(zhì)中成纖維細(xì)胞和TGF-β1的重要來源，更是各種環(huán)境因素作用的起點(diǎn)。反之，成纖維細(xì)胞由于與外界環(huán)境相對隔離，且無逆向影響上皮的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)，因此更符合效應(yīng)細(xì)胞而非始動細(xì)胞的地位。

就上皮細(xì)胞中發(fā)生的相關(guān)事件(EMT等)而言，多為對現(xiàn)象的闡述而非探究其根本原因。IPF中上皮活化的原因是一種至今不明的肺泡上皮細(xì)胞損傷，而這使上皮細(xì)胞獲得了一種不易受外界因素調(diào)控的、相對自主的生物學(xué)行為。在非腫瘤性的因素中，能以這種方式改變細(xì)胞的生物學(xué)行為的，無疑包括病毒，因?yàn)樗芡暾靥峁牟∫虻讲±肀憩F(xiàn)在內(nèi)的所有解釋。但是，尋找病毒在上皮細(xì)胞中存在的依據(jù)，還有相當(dāng)?shù)碾y度。不過，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的凋亡和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等現(xiàn)象，已經(jīng)朝著解釋上皮細(xì)胞的生物學(xué)行為方面，邁出了重要的一步。

雖然并不能否認(rèn)單個細(xì)胞因子或通路的研究對于理解IPF的發(fā)病機(jī)制和開發(fā)治療藥物具有重大意義[42]，但是，著眼于關(guān)鍵細(xì)胞成分的、更具有針對性的研究，有可能縮短解開IPF發(fā)病機(jī)制之謎的時間。

參 考 文 獻(xiàn)

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