內皮祖細胞在缺血性卒中后血管再生中的作用

謝宸宸，羅勇

卒中是威脅人類健康的三大疾病之一。每年全球約有550萬人死于卒中[1]。每年因卒中死亡人數占全部死亡人數的9.7%，發展中國家卒中患病人數占全球患病人數的85%[2]。專家預測，如無有效的臨床和公共衛生干預，2030年初患卒中的人數將升至2300萬，卒中死亡人數將升至780萬。其中，缺血性卒中占卒中的88%[3]。缺血性卒中后血管再生、腦循環結構與功能的重建是腦神經網絡結構和功能重建的重要基礎、前提及保障[4]。缺血性卒中后的血管重建通過內皮祖細胞（endothelial progenitor cell，EPC）增殖、遷移、分化形成新生血管，有效地促進腦缺血組織的血管再生[5]。研究提示，EPC可促進缺血組織的血管再生和修復，促進缺血性卒中患者的神經功能恢復，同時也可獨立預測心腦血管疾病患病風險[6]。含EPC的人自體細胞治療可用于治療心腦血管疾病及其他周圍血管缺血性疾病[7]。目前EPC在缺血性卒中后血管再生中的作用受到廣泛重視。現就近期EPC及其在缺血性卒中后腦內血管再生中的作用做一綜述。

1 EPC的生物學特點

EPC分為造血系統來源EPC和非造血系統來源EPC，其中造血系統來源EPC包括形成集落的EPC、不形成集落的EPC、骨髓源性EPC等，主要存在于骨髓。

EPC表面標記有：CD34、VEGFR2、CD133、c-Kit、Sca-1、CD45、CD14、CD11、vWF等。在成血管祖細胞衍變為成熟內皮細胞（endothelial cell，EC）的過程中，EPC可能呈現多種細胞表面標記，故通過細胞表面標記鑒定EPC亦具挑戰性。以往，多認為CD34+/VEGFR2+/CD133+細胞即為EPC，但近來發現其更可能是造血干細胞而非EPC，認為其并不能分化為EC[8]。Yang等[9]發現，與Lin－、c-Kit+、Sca-1+，Lin－、c-Kit+，Lin－、Sca-1+聯合標記相比，僅CD34+標記的EPC具有更強的歸巢及成血管能力，認為CD34可能更適合用以分選功能性EPC。CD34－細胞促血管再生能力的喪失，再次突顯了CD34+細胞的促血管再生作用[10]。Madeddu等[11]認為CD34+VEGFR2+細胞可能占EPC的大部分比例，認為更多抗原標記結合雖可能更特異地鑒定EPC，卻會造成更低的檢出率。因此，如何選擇簡單而特異的抗原標記鑒定EPC是未來研究的目標之一。

至今仍無特異鑒定EPC的方法，目前主要采用的方法有：細胞培養及細胞集落形成試驗；EPC表面抗原標記分選EPC亞型。根據體外培養EPC時程長短，可分為4種類型：①早期EPC：主要表達CD45、CD14、CD11等早期表面標志[12]；②內皮細胞集落形成單位（colonyforming units-EC，CFU-EC）：其歸類為EPC目前頗有爭議，有研究認為將其命名為循環內皮細胞更為合適，因其在體內可能通過不分化為EC的方式促進血管再生[13]；③晚期EPC：由早期EPC進一步長時培養而得，更富成熟EC特性[10]；④EC克隆形成細胞（endothelial colony-forming cells，ECFC）：可不表達骨髓系和造血系表面標志，具有強大的EC分化潛能。ECFC的來源仍不清楚，有研究者認為其可能來源于血管壁，若此假設成立，ECFC可能就不是真正的干細胞，而是具強增殖能力的EC[14]。目前大多認為短時程培養的EPC（如早期EPC、CFU-EC）主要通過分泌促血管再生因子以促進血管的形成，而長時程培養的EPC（如晚期EPC、ECFC）則主要通過分化為EC而促進血管再生[15]。目前雖說把EPC分為早期和晚期EPC受到了大多學者的認可，但由單核細胞培養所得細胞仍比較混雜，這種分類方法是否正確還有待考證。

2 EPC與缺血性卒中

2.1 外周血EPC水平與缺血性卒中后功能恢復及預后的關系 缺血性卒中后外周血EPC水平與腦梗死面積及預后明顯相關。Taguchi等[16-17]采用流式細胞術檢測缺血性卒中已發作3年及以上患者的外周血EPC數量，并通過顱腦磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）計算梗死面積、腦氧代謝率和正電子發射斷層掃描評估患者的腦血管功能情況，對患者行1年的隨訪后，再次檢測外周血EPC數量，美國國立衛生研究院卒中量表（National Institutes of Health Stroke Scale，NIHSS）評價患者神經功能恢復情況。結果發現CD34+EPC數量與梗死面積、腦血管功能密切相關，且CD34+細胞水平可預測神經功能的恢復情況。Ghani等[6]采用流式細胞術檢測病程＜4 h的急性缺血性卒中患者的外周血CD31+vWF+EPC數量，收集患者的患病年齡，吸煙、高血壓、糖尿病、高脂血癥等心腦血管疾病危險因素，并進行Framingham風險評分，結果發現CD31+vWF+EPC數量與患病年齡、心腦血管疾病危險因素及Framingham風險評分顯著相關。Brea等[18]采用蛋白質組學方法，分析急性缺血性卒中患者及正常人的外周血EPC的蛋白表達，發現兩者EPC的蛋白表達種類及量不同，考慮這種差異可能與缺血性卒中應激對EPC功能的調控相關。EPC不僅可預測缺血性卒中的預后及神經功能情況，同時其對缺血性卒中的發作亦有一定保護作用。如李龍宣等[19]通過檢測既往有同側短暫性腦缺血發作（transient ischemic attack，TIA）史的缺血性卒中發作24 h內的患者外周血CD34+KDR+EPC數量，NIHSS評價其入院時的神經功能，顱腦計算機斷層掃描（computed tomography，CT）測量腦梗死體積，發現前期TIA發作可促進循環EPC的動員，而早期外周血EPC數量可決定急性腦梗死的嚴重程度，故推測前期TIA發作對EPC的動員作用引起的循環EPC數量增加可能改善急性腦梗死的嚴重程度，指出前期TIA發作引發的EPC數量增加對后繼缺血性卒中發作具有一定保護作用。總之，外周血EPC數量與腦缺血發作及其預后明顯相關，其可用于評估具有血管危險因素患者的腦缺血發作可能及其預后。如何上調外周血EPC水平以增加腦內血管再生及改善缺血性卒中預后是治療研究的重要靶點。

2.2 EPC移植在缺血性卒中后血管再生中的作用 缺血性卒中后EPC可通過增殖、遷移、歸巢至腦缺血區域參與腦內血管再生。Moubarik等[20]將臍帶血中分離培養的ECFC通過股靜脈移植至大腦中動脈阻塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）大鼠體內并通過放射性標記追蹤，發現移植24 h后ECFC即可定植到腦缺血區，增加堿性磷酸酶標記的微血管密度，并改善神經功能缺損程度評分（modified Neurological Severity Score，mNSS）。Hess等[21]靜脈移植綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）標記的骨髓源性細胞至MCAO大鼠眼眶后竇，發現缺血后3～7 d即可見GFP標記的骨髓源性細胞參與缺血區域的血管再生。EPC移植促進血管再生的同時也促進神經修復。富奇志等[22]將大鼠分為假手術組、缺血對照組、缺血后神經干細胞（neuron stem cell，NSC）移植組（NSC組）、缺血后EPC移植組及NSC+EPC移植組，移植區域為大腦缺血半暗帶區，結果發現各時間點NSC+EPC組血管新生數量明顯多于NSC組、EPC組和缺血對照組，EPC可以促進移植入MCAO模型大鼠缺血半暗帶的NSC增殖，減少其凋亡，2種細胞共移植可以促進缺血半暗帶的血管新生。EPC移植雖可強有力地促進缺血性卒中后的血管再生，但外源性的EPC的運用目前仍存在多種未解決的問題，如移植途徑、時間、數量、細胞來源及其安全性均有待進一步研究。

2.3 EPC及SDF-1α/CXCR4軸在缺血性卒中后血管再生中的作用 缺血性卒中后腦缺血區可釋放缺氧誘導因子-1（hypoxia-inducible factor，HIF-1）、血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、基質蛋白衍生因子-1α（stromal derived factor-1α，SDF-1α）、紅細胞生成素等，激活并動員骨髓EPC入血。其中，SDF-1α/CXCR4軸在缺血性卒中后EPC的動員、遷移、歸巢中的作用受到廣泛關注。研究發現MCAO大鼠側腦室內予以SDF-1α，可增加腦缺血區血流量，誘導骨髓源性細胞至腦缺血區，減少梗死體積[23]。SDF-1α與其受體CXCR4結合可通過激活多種信號轉導通路而介導其生物學行為。CD34+CD133+KDR+EPC可表達大量CXCR4受體，而SDF-1α能增強其遷移、黏附能力。過表達CXCR4的EPC尾靜脈移植可減少腦缺血糖尿病模型小鼠的腦梗死體積，上調腦缺血區的微血管密度[24]。Paczkowska等[25]發現缺血性卒中患者1 d、3 d和7 d的外周血中CD133、CD34和CXCR4表達的增加均伴隨有血漿SDF-1α表達的增加，且急性缺血性卒中患者的SDF-1α水平與早期外周血EPC數量相關[19]。孫宏毅等[26]采用祖國傳統醫學電針干預大鼠“合谷穴”，發現MCAO后大鼠外周血SDF-1α的表達上調，骨髓和外周血VEGFR2+EPC、CXCR4+EPC數量增加，而電針可進一步增加外周血EPC數量及SDF-1α的表達。同時，外周血SDF-1α濃度可作為循環EPC數量的預測指標。Xiao等[27]對Bruneck研究群體的SDF-1α、CXCR4的單核苷酸基因多態性、外周血血漿SDF-1α和EPC數量等進行研究，發現SDF-1α基因多態性能夠影響血漿SDF-1α濃度、循環EPC數量。綜上所述，SDF-1α可能增強腦缺血后EPC的動員、遷移和歸巢至缺血區域，且這一過程與SDF-1α/CXCR4軸密切相關。

EPC不僅可用于評估和預測心血管疾病，亦可用于評估具有血管危險因素患者缺血性卒中發作的可能并評估其預后。EPC動員、遷移、歸巢參與腦缺血區血管再生機制很多，希望可以探索出簡單有效并可廣泛應用于臨床的干預手段，以達到改善缺血性卒中患者的治療效果并促進患者康復的目的。近年來對缺血性卒中后EPC在血管再生中作用的研究多采取了細胞移植的手段，而整體水平的研究較少，對于機體內源性EPC在腦缺血損傷后重要的促血管再生作用研究較少，且外源性EPC的運用目前仍存在多種未解決的問題：如如何通過血腦屏障；如何選擇更為有效的EPC植入途徑；如何克服外源性EPC移植后的衰老、死亡，如何增強其存活能力；EPC最佳移植數量及最佳移植時間；如何保持外源性EPC的遺傳穩定；如為異體移植，如何克服其免疫排斥反應等等。因此，應進一步增加關于內源性EPC在缺血性卒中后腦內血管再生中作用的研究。目前尚無特異的EPC鑒定方法，因此在一定程度上限制了內源性EPC的鑒定及其相關的研究。如何選擇簡單且更為特異的抗原標記鑒定EPC是未來研究的目標之一。EPC主要存在于骨髓，缺血性卒中應激對機體自身骨髓EPC的調動能力有限，故有效調動并促進EPC歸巢參與血管再生的干預手段十分必要。總之，EPC的功能及鑒定的不確定性在一定程度上限制著EPC從缺血性卒中的基礎研究向臨床實踐應用的延伸。為精確鑒定EPC，了解其根本生物學特性，理清其促進缺血性卒中后血管再生的作用機制，探索動員內源性EPC的有效干預手段，并應用于臨床診療，還需做進一步深入的探索。

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【點睛】

內皮祖細胞可通過增殖、動員、遷移、分化為內皮細胞，從而參與缺血性卒中后的腦內血管再生。