腫瘤相關性巨噬細胞在非小細胞肺癌中的研究進展

白翠青 姚艷雯 宋 勇

巨噬細胞是機體免疫反應中的一種重要細胞，既往認為其可直接殺傷腫瘤細胞或者通過抗原提呈作用誘導機體免疫應答進而清除腫瘤細胞，在抗腫瘤免疫調節中發揮著重要作用。然而，近年來越來越多的研究表明腫瘤微環境中浸潤的巨噬細胞即腫瘤相關性巨噬細胞(tumor associated macrophages, TAMs) 不但不能起到抗腫瘤的作用，相反具有促進腫瘤進展的作用。既往的研究已經提示TAMs的廣泛浸潤與乳腺癌、卵巢癌、宮頸癌等的不良預后有關[1-2]。但TAMs在非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)的作用尚有爭議?，F就TAMs在NSCLC中的研究進展進行綜述。

一、腫瘤相關巨噬細胞

1. TAMs的來源: TAMs是特指聚集在腫瘤微環境中的巨噬細胞，其來源于外周循環血中的單核細胞。腫瘤組織通過釋放一些趨化因子，如單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein, MCP-1，又稱CCL2)、巨噬細胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor, M-CSF)、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)等，將外周血單核細胞招募進入腫瘤組織內，在腫瘤微環境的誘導下分化形成TAMs[3]。有文獻報道TAMs多浸潤于腫瘤的缺氧部位，這可能是由于缺氧可提高前列腺素的濃度和TAM對趨化因子的敏感性，進而促進其浸潤[4]。

2. TAMs的表型及其分子標志物： 巨噬細胞具有很高的可塑性，在不同微環境的作用下，表現出不同的表型和功能。根據巨噬細胞的活化狀態和功能，可分為兩種：一種為促炎型即經典活化的巨噬細胞(M1型)，另一種為抗炎型即替代活化的巨噬細胞(M2型)[5]。M1型巨噬細胞由Th1型免疫應答的介質如干擾素(interferon, IFN)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)誘導形成。表現較高的抗原提呈能力，釋放如白介素-12(interleukin, IL-12)、IL-23等促炎因子，高表達IL-12，低表達IL-10，誘導Ⅰ型免疫應答，對抵御細胞內細菌和病毒及抗腫瘤有重要作用。

M2型巨噬細胞則是由Th2型免疫應答的介質如IL-4和轉化生長因子B(transforming growth factor, TFG-B)誘導形成，在血管生成、創傷愈合、組織修復及抗炎等過程中發揮重要的作用。M2型巨噬細胞典型的分子標志包括CD68、CD163、清道夫受體(scavenger receptors, SR-A, 又名CD204)、甘露糖受體(macrophage mannose receptors, MMR，又名CD206)、精氨酸酶1(arginase 1, Arg-1)。M2型巨噬細胞低表達IL-12、高表達IL-10，誘導Ⅱ型免疫應答[6]。

過去幾年，Sica和Mantovani等[3,7]指出M1和M2型巨噬細胞共存于腫瘤微環境中，在一定的條件下，TAMs的表型是可以轉化的，TAMs可發生M2型活化，呈現M2型巨噬細胞的特征。近幾年來多數文獻也報道TAMs呈M2型活化表型[8-11]。

二、TAMs在NSCLC中的表型及其與NSCLC預后的關系

Kim等[12]用CD68作為巨噬細胞標志，對144例NSCLC患者手術標本進行免疫組化分析，發現癌巢高密度巨噬細胞的患者比癌巢低密度巨噬細胞的患者生存時間長，5年生存率分別是63.9%和38.9%，多變量分析也發現癌巢巨噬細胞數量是一個獨立的預后因素，但該研究未涉及巨噬細胞的表型。Ohri等[13]用CD68作為巨噬細胞的特異性標志物，HLA-DR、 iNOS、MRP 8/14、TNF-α，作為M1型巨噬細胞的標志物，CD163、VEGF作為M2型巨噬細胞的標志物，對40例NSCLC手術標本的癌巢和腫瘤間質巨噬細胞進行了免疫組化分析，結果顯示癌巢中M1型巨噬細胞和M2型巨噬細胞共存。在生存期長的患者中，70%癌巢巨噬細胞表現為M1型，38%表現為M2型，癌巢間質的M1型巨噬細胞所占比例明顯高于M2型巨噬細胞比例，并且統計分析提示癌巢M1型巨噬細胞數量與預后正相關，而間質的巨噬細胞數量與生存期長短無關。

Ma等[14]用CD68/HLA-DR作M1型巨噬細胞標志，CD68/CD163作M2型巨噬細胞標志，對100例NSCLC患者的手術標本進行免疫組化計數癌巢和間質的巨噬細胞。分析發現在NSCLC中約70%的TAMs為M2型巨噬細胞，30%為M1型巨噬細胞，但無論癌巢、間質或者總M2型巨噬細胞的密度與患者生存期無明顯關系，而M1型巨噬細胞的密度(包括癌巢、間質或癌巢和間質的巨噬細胞總數)與患者生存時間呈正相關。

Zhang等[15]用CD68和iNOS作為M1型巨噬細胞的標志物，CD68和MMR作為M2型巨噬細胞的標志物對65例肺腺癌的患者手術標本行免疫組化檢測也發現TAMs主要變現為M2型，其數量與預后差相關，但作者并未區分癌巢和間質的巨噬細胞。

Ohtaki等[16]以CD204和CD68作為M2型巨噬細胞的鑒定標志物，對170例手術切除的肺腺癌標本進行免疫組化檢測并且結合臨床患者資料進行生存分析，發現大多數肺腺癌患者中的間質巨噬細胞表現為CD204和CD68陽性的M2型巨噬細胞，而且其浸潤的數量與預后呈負相關。而Carus等[17]用CD163作為巨噬細胞標志，通過免疫組化分析305例NSCLC癌巢和間質的巨噬細胞發現，CD163陽性的巨噬細胞數量與患者無復發生存期和總生存期無明顯直接關系。

由此可見，在NSCLC中巨噬細胞的表型及其與預后的關系尚存在爭議，這可能與巨噬細胞選用的標志物不統一及臨床樣本較少有關。綜合上述文獻研究可初步認為在癌巢中巨噬細胞可能主要表現為抗腫瘤的M1型巨噬細胞，并且其數量與理想的臨床預后相關，而間質中的巨噬細胞可能表現為促腫瘤的M2型，且其數量與臨床預后較差相關。

三、TAMs與NSCLC的侵襲與轉移

1. TAMs促進NSCLC肺癌細胞侵襲： Hirayama等[18]用CD204作為巨噬細胞的標志，對208例肺鱗癌手術患者標本結合臨床病理發現，在腫瘤間質CD204巨噬細胞增加的患者中，腫瘤的胸膜侵襲率明顯增加。Chen等[19]則通過體外共培養的方法，發現與巨噬細胞共培養后肺癌細胞的侵襲能力和基質降解活性均增加。Wang等[20]從人肺癌組織提取原代巨噬細胞與SPCA1、 H460 和A549等肺癌細胞株體外共培養后發現，這些肺癌細胞的遷移和侵襲能力明顯增加，同時實時定量PCR檢測到TAMs中IL-10，基質金屬蛋白酶-9( matrix metalloproteinases-9, MMP-9)，尿激酶型纖溶酶原激活物(urokinasetype plasminogen activator, uPA)，VEGF，環氧化酶-2 (cyclooxygenase-2, COX-2)，血小板源性生長因子(platelet-derived growth factor, PDGF)，組織蛋白酶(cathepsin K)，和肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor, HGF)基因表達上調。抗uPA單克隆抗體和MMP-9單克隆抗體能夠抑制TAMs介導的侵襲能力，進一步說明肺癌細胞侵襲能力的增加可能與MMP-9有關。

2. TAMs與NSCLC的血管生成： 近年來，TAMs在腫瘤血管生成中的作用逐漸受到人們的重視。1996年，Leek等[21]通過TAMs密度與腫瘤血管密度計數發現在乳腺癌中二者呈正相關，提示TAMs可能影響腫瘤血管生成。之后TAMs與血管生成的相關性相繼在其他腫瘤中被證實。各種小鼠腫瘤模型為TAMs在腫瘤中促血管生成的作用提供了確定的證據。Bingle等[22]通過在裸鼠皮下分別接種包有巨噬細胞和乳腺腫瘤細胞的瓊脂糖體和只包有腫瘤細胞的瓊脂糖體，計數兩組中瓊脂糖周圍血管生成的密度，發現含巨噬細胞組與只含腫瘤細胞組相比，前者血管生成明顯增加，首次在體外證明了巨噬細胞浸潤在腫瘤血管生成中的作用。之后Zeisberger等[23]通過腹腔注射氯磷酸鹽脂質體特異性清除小鼠臍胎瘤和橫紋肌瘤模型中的巨噬細胞，繼而通過免疫組化發現腫瘤生長和血管生成受到明顯抑制。

在人肺癌中，Chen等[19]通過計數41例肺癌患者腫瘤內微血管和巨噬細胞的密度，發現TAMs數量和微血管密度呈正相關。但Ogawa等[24]的研究顯示腫瘤細胞和間質TAMs中VEGF-C的表達水平與腫瘤大小和血管生成并不相關。Lissbrant等[25]的發現或許可以解釋這個問題，他們認為血管生成并非與總的TAMs計數有關，還需考慮TAMs的功能狀態(如正在執行的功能是抗原提呈還是血管形成)和其在腫瘤中所處的位置，單純的TAMs并不是獨立的預后因素。

關于巨噬細胞促進腫瘤血管生成的機制如下：①產生促血管生成因子：TAMs表達大量的促血管生成因子，包括VEGF-A和基本成纖維細胞(basic fibroblast growth factor, bFGF)等直接誘導腫瘤內血管生成[26]。TAMs也能產生大量的包括IL-1B、TGF-B1、TNF-a在內的細胞因子,能通過促進腫瘤微環境中的其他類型細胞釋放VEGF-A等促血管生成因子，從而間接促進新血管形成[27-29]；②產生基質降解酶：TAMs能產生一些酶，如MMPs-2，-7，-9，-12[30-32]，這些酶改變了細胞外基質(extracellular matrix ，ECM)的結構，促進了活化內皮細胞的黏附、遷移和侵襲能力，進而促進腫瘤血管生成，而且MMPs和ECM相互作用也能增加這些促血管生成因子如VEGF-A和bFGF的活性，間接促進腫瘤血管生成；③TAMs能表達重要的促血管生成酶胸腺嘧啶磷酸化酶(thymidine phosphorylase，TP)，該酶已被證實與胃癌有關)，其可促血管生成分子修飾死亡或即將死亡的細胞釋放的DNA，進而促進血管生成；④其他：TAMs也能通過其他一些額外的途徑促進腫瘤血管生成，這包括募集CD34+AC13內皮細胞或者CD34-CD14+外周血單核細胞[33]。CD14+CD34外周血單核細胞表達有經典的內皮細胞標志VEGFR-2+和血管性血友病因子+(von Willebrand factor +，vWF+)[34]。

3. TAMs與NSCLC的淋巴管生成： 區域性淋巴結轉移也是NSCLC的重要轉移途徑與預后指標之一。淋巴管生成是腫瘤發生淋巴結轉移的初始步驟，VEGF-C和VEGF-D是目前發現的最重要的淋巴管生成因子，腫瘤細胞分泌的VEGF-C和VEGF-D均可與及其受體VEGFR-3結合，通過促進淋巴管內皮細胞存活、增殖和遷移介導腫瘤淋巴管生成。

近年來研究發現，TAMs也能通過誘導淋巴管生成促進腫瘤發生淋巴結轉移。體外研究證實在小鼠肺腺癌移植瘤中，TAMs主要傾向為M2型巨噬細胞，且M2型巨噬細胞能夠通過上調VEGF-C表達和誘導小鼠淋巴管內皮細胞增殖、遷移和管樣結構形成等方式促進小鼠肺腺癌淋巴管生成[35]。Zhang 等[36]研究發現人肺腺癌M2型巨噬細胞浸潤與TNF分期、微淋巴管密度、淋巴結轉移密切相關，與患者總生存期呈明顯負相關，其可能原因為M2型巨噬細胞促進了淋巴管生成和淋巴結轉移。但Kojima等[37]發現TAMs數量與T1期NSCLC患者VEGF-C、VEGFR-3表達及部分臨床病理參數之間均無相關性。Ogawa等[24]對206例I-IIIA期行手術的NSCLC患者分析，發現60.7%的患者腫瘤細胞中VEGF-C表達增高，71.2%的患者間質巨噬細胞中VEGF-C增加，但腫瘤細胞或者間質巨噬細胞的VEGF-C的表達與淋巴結或血管生成無關。多變量分析發現腫瘤內VEGF-C的表達才是有意義的預后因子?？梢娫贜SCLC中，巨噬細胞的促腫瘤淋巴管生成結論尚不統一，有待于進一步的研究。

四、TAMs與腫瘤治療

TAMs在腫瘤發生發展和臨床預后中有重要意義，使它成為一種新的治療靶點。目前針對TAMs靶向治療腫瘤的基本策略包括以下幾方面：①減少TAMs的募集：TAMs的產生主要是依賴于CSF-1和CCL2等這些細胞因子的調節，通過抑制巨噬細胞的這些趨化因子，減少或阻斷巨噬細胞向腫瘤組織的浸潤，在一定程度上或許能夠抑制TAMs的促腫瘤作用。針對該作用的藥物，如CNTO888，是一種能與巨噬細胞的CCR2受體結合的單克隆抗體，正在臨床評估階段[38]；②直接破壞巨噬細胞：直接消除或減少腫瘤微環境中的巨噬細胞，如選用唑來膦酸、氯膦酸鹽脂質體等[23]；③逆轉TAMs的分化：如使用 CpG DNA 和IL-10 受體抗體能實現巨噬細胞從 促腫瘤的M2型轉變成抗腫瘤的M1型[39]; ④抑制TAMs誘導的腫瘤血管生成：眾所周知，抑制腫瘤血管生成能抑制腫瘤進展，但是傳統的VEGF單克隆抗體如貝伐單抗或者舒尼替尼只能產生短期的效果，甚至有時會導致腫瘤進展[40]，這可能是因為選擇性阻斷特定的促血管生成因子及其受體并沒有完全阻斷腫瘤血管生成[41]。TAMs在腫瘤血管生成中也發揮著重要作用，因此開發一些能抑制TAMs釋放促血管生成因子的藥物，或許能大大抑制腫瘤血管的生成。

綜上所述，現有研究已逐漸證實了TAMs浸潤在促進腫瘤發展中發揮著重要作用，其中主要機制可能是巨噬細胞能通過釋放某些細胞因子和酶促進腫瘤血管和淋巴管的生成，進而促進腫瘤進展。TAMs在NSCLC中的促腫瘤作用，可能為臨床有效治療NSCLC提供了新的靶點，但是目前關于TAMs在NSCLC中的分型及其與肺血管、淋巴管生成之間的關系及預后均未達到一致的認識，仍需要進一步的研究證實。

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