銅綠假單胞菌誘導氣道上皮細胞產生MUC5AC的分子機制

[摘要] 目的 探討銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，Pa）誘導氣道上皮細胞表達產生粘蛋白MUC5AC的影響，并探討其可能的分子機制。 方法 體外培養NCI-H292細胞，用Pa感染后，采用ELISA檢測MUC5AC的產生情況；并用商品化的MMP-9活性檢測試劑盒檢測其產生以及酶活性情況。同時，采用EGFR，PI3K，NADPH，ROS 和MMP特異性抑制劑AG1478，LY294002，DPI，NAC和GM6001預處理NCI-H292細胞，觀察MUC5AC以及MMP-9的產生情況。 結果 Pa能以時間依賴性方式誘導NCI-H292細胞產生MMP-9，并增加其活性。EGFR活化后，經PI3K途徑激活Rac1并誘導MMP-9的表達，最終誘導MUC5AC產生。 結論 Pa經EGFR/PI3K/Rac1/NADPH/ROS/MMP-9通路誘導NCI-H292細胞產生MUC5AC。

[關鍵詞] 銅綠假單胞菌；基質金屬蛋白酶-9；MUC5AC

[中圖分類號] R562.22 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2013）29-0001-03

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是世界上第四位的主要死亡原因[1]。對于某些患者而言，呼吸道粘液過度分泌是導致COPD急性發作的重要特征[2]。作為機體抵御外來病原體感染的重要保護屏障，粘液是固有免疫系統的重要組成部分[2，3]。但病理條件下引起的粘蛋白過度表達往往會導致呼吸受限或換氣不足[2，4]。在已經鑒定出的20多種粘蛋白中，以凝膠粘蛋白MUC5AC研究最多[5]。研究表明，MUC5AC在肺部表達較高，多種細菌性刺激均可上調其分泌。本研究旨在探討銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，Pa）誘導人氣道上皮細胞NCI-H292產生MMP-9的分子機制，并探討其在誘導產生MUC5AC中的作用。

1 材料與方法

1.1 試劑與菌株

鼠抗人MUC5AC單克隆抗體購自Sigma。HRP標記羊抗鼠多克隆抗體購自Santa Cruz。CM-H2DCFDA為MolecularProbes產品，NSC23766 購自Tocris。特異性抑制劑AG1478（EGFR），LY294002（PI3K）、DPI（NADPH），NAC （ROS），GM6001 （MMP）購自Sigma。Pa和NCI-H292細胞株購自ATCC。胎牛血清、RPMI1640為Gibco公司產品。

1.2 Pa培養

挑取PA單菌落，在LB液體培養基中37℃下震蕩培養3 h，取200 μL菌液接種至LB瓊脂平板，37℃過夜培養。PBS洗脫平板上細菌并收集到Eppendorf管中，10 000 rpm離心10 min，PBS洗滌沉淀2次。分光光度計測定菌液OD值（650 nm）并計算細菌的濃度。

1.3 NCI-H292細胞培養

人氣道上皮細胞系NCI-H292細胞用含10% FBS、100 U/mL青霉素及100 μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養基中于5% CO2 37℃的環境下生長。實驗前，將細胞按密度為5×105/孔接種于6孔板中。Pa刺激前，細胞于無血清條件下培養24 h，加入培養的Pa共感染9 h。在研究抑制劑效應時，NCI-H292細胞預先用相應的抑制劑刺激1 h，隨后再用Pa感染。本研究當中所用的抑制劑濃度分別為：10 μM AG1478、20 μM GM6001、50 μM NSC23766、50 μM LY294002、15 μM DPI和30 mM NAC。

1.4 明膠酶譜實驗

細胞用無血清培養基培養24 h后，收集上清，加入Laemmli 樣品緩沖液并經含1 mg/mL明膠的SDS-PAGE（分離膠10%）。電泳結束后，加入含2.5% Triton-X-100復性液孵育30 min以去除SDS。隨后將凝膠用50 mmol/L HCl（pH 7.4），5 mmol/L CaCl2和1 μmol/L ZnCl2于37℃下孵育過夜。加入0.05%考馬斯亮藍R-250室溫染色30 min，去離子水脫色，拍照，灰度掃描。

1.5 Rac1活性檢測

裂解處理后的NCI-H292細胞，根據Cytoskeleton公司生產的G-LISATM Activation Assay試劑盒的操作說明測量Rac1的活性。本試劑盒采用ELISA原理測量小G蛋白中結合GTP（活性形式）的含量而加以確定。測量組熒光強度/對照組強度的比值即為Rac1的相對活性。

1.6 ROS檢測

NCI-H292細胞刺激結束后，加入10 μM CM-H2DCFDA用于檢測自由基的活性。熒光強度采用熒光分光光度計（Hitachi F-2000）進行分析，其中激發波長為488 nm，發射波長為530 nm。ROS含量根據標本熒光強度/對照品熒光強度的比值表示。

1.7 ELISA檢測MUC5AC的產生

采用酶聯免疫分析測量MUC5AC蛋白的含量。細胞處理結束后，棄上清，隨后用4℃ PBS洗滌細胞。并加入裂解緩沖液（20 mM Tris-HCl，133 mM NaCl，1% NP-40及10%甘油）裂解細胞。離心獲取裂解上清液并測定其濃度后置于-80℃。檢測MUC5AC時，取裂解上清液置于96孔板中，40℃下烘干。加入2%胎牛血清于37℃封閉1 h，隨后加入含0.05% Tween-20的MUC5AC抗體（PBS稀釋）孵育1 h，結束后加入二抗，37℃ 1 h。TMB法顯色后，再加入2N H2SO4終止反應。酶標儀下讀取450 nm下的吸光度。

1.8 統計學分析

計量資料以（x±s）表示。計量資料采用t檢驗。組間比較采用單向方差分析后行Dunnet t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Pa經EGFR誘導NCI-H292細胞分泌并激活MMP-9

NCI-H292細胞靜息狀態下，MMP-9表達量非常少。當經Pa感染后，能以時間依賴性方式誘導產生NCI-H292細胞，當感染時間為9 h時，MMP-9含量為對照組的3.7倍。此外，MMP-9的酶活性也隨感染時間的延長而增高。9 h后酶活性是對照組的3.1倍。NCI-H292細胞經EGFR抑制劑AG1478處理后，MMP-9蛋白分泌水平減少52.2%，活性降低61.2%，見表1。

2.2 Pa經EGFR和PI3K通路激活Rac1

Pa感染NCI-H292細胞9 h后，Rac1活性增加了3.8倍。已有研究表明，Pa感染能激活EGFR和PI3K。為了進一步探討Rac1的激活與EGFR和PI3K的關系，NCI-H292細胞分別與EGFR和PI3K特異性抑制劑AG1478以及LY 294002處理后，結果顯示，AG1478能將Rac1活性降低了54.5%，LY294002能將其活性降低49.2%。見表2。

2.3 Pa誘導的MMP-9產生與活性的改變受Rac1和ROS調控

NCI-H292細胞靜息狀態下，ROS表達量較低。經Pa感染后，ROS含量為對照組的2.3倍。NADPH和Rac1抑制劑DPI和HSC23766處理后，ROS水平顯著降低（表3）。NCI-H292細胞感染前用ROS特異性抑制劑NAC預處理后，MMP-9含量減少了56.7%，活性降低了71.4%。此外，NCI-H292細胞用Rac1特異性抑制劑NSC23766預處理，MMP-9的含量與活性分別降低了60.3%，活性降低至68.5%。

2.4 Pa誘導的MUC5AC受Rac1/ROS介導的MMP-9調控

Pa感染NCI-H292細胞后，MUC5AC產生量為對照組的3.8倍。NSC23766，DPI或NAC處理后，MUC5AC分泌降低了65.6%、57.9%和50.0%。MMP-9抑制劑GM6001也能抑制44%的MUC5AC產生。

3 討論

盡管有研究顯示Pa能誘導MMP-9產生后調控MUC 5AC的產生，但其潛在的分子機制尚不明確[6]。本研究采用Pa細胞感染NCI-H292細胞后，能明顯誘導MMP-9的表達，并導致其活性大大增高，且EGFR特異性抑制劑AG1478處理后顯著逆轉該效應，這表明MMP-9的產生有賴于EGFR。隨后發現RGFR抑制后，也能抑制Rac1的活性。且PI3K特異性抑制劑LY294002處理對Rac1也具有一定程度的抑制效應，這表明PI3K在介導EGFR激活Rac1中發揮重要作用。通過采用特異性抑制劑，本研究證實Rac1參與了Pa誘導的MMP-9產生，且PI3K也發揮重要作用。以上結果表明Pa感染能通過EGFR途徑促進NCI-H292細胞分泌MMP-9，同時也顯示RGFR下游的信號通路如PI3K依賴性對Rac1介導MMP-9的分泌與激活。

ROS是細胞當中一類生理性物質，但在某些呼吸系統疾病如COPD中，是重要的危險因素，而多種病原體可以引起ROS的產生。本研究也證實，NADPH氧化酶也參與了Pa誘導的ROS產生，Rac1和ROS兩者共同調控MMP-9的分泌與激活[7]。為了進一步證明MUC5AC受MMP-9和ROS調控。給予相應的抑制劑處理后，MUC5AC表達水平顯著降低，再次表明當MMP-9激活后，能促進MUC5AC產生。

總之，本研究證實MUC5AC的產生受MMP-9調控，而Rac1在此過程中發揮重要的調控作用，這為COPD等疾病的治療提供的新的作用靶點。但Rac1是機體正常生理功能所必須的，尤其是Rac1參與了巨噬細胞的吞噬功能，這對于機體清除細菌感染而言至關重要[8，9]，因此以Rac1為作用靶點的藥物開發治療COPD等呼吸系統疾病，必須考慮細胞特異性的問題，以減少其副作用。

[參考文獻]

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（收稿日期：2013-08-06）