miR—34a對人成骨肉瘤MG—63細胞生長增殖的影響

[摘要] 目的 探討miR-34a對人成骨肉瘤MG-63細胞增殖的影響。 方法 運用miR-34a的mimics或inhibitors分別轉染人成骨肉瘤MG-63細胞，分別為實驗組，脂質體2000為對照組，采用甲基噻唑基四唑（MTT）法檢測細胞增殖情況。 結果 對照組吸光度值在24 h、48 h和72 h分別為（0.33±0.02）、（0.55±0.03）、（0.75±0.06）；miR-34a mimics可抑制MG-63細胞增殖，其吸光度值分別降至（0.21±0.02）、（0.26±0.03）、（0.31±0.04），經統計學分析，差異有統計學意義（P < 0.01）；miR-34a inhibitors可使人成骨肉瘤MG-63細胞的增殖活性增強，其吸光度值分別增加到（0.41±0.05）、（0.71±0.08）、（0.94±0.08），經統計學分析差異有統計學意義（P < 0.01）。 結論 miR-34a可使人成骨肉瘤細胞的增殖活性下調，其在骨肉瘤的發生發展中可能發揮一個抑瘤基因的作用。

[關鍵詞] miR-34a；人骨肉瘤；細胞生長

[中圖分類號] R738.1 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701（2013）21-0023-02

眾所周知，miRNA成為分子生物學研究熱點，人類miRNA充當癌基因或抑癌基因的作用調控其靶基因的表達及相關信號通路，在腫瘤的發生、發展和轉歸過程中發揮重要作用[1，2]。miRNA參與個體發育、造血、脂肪代謝、器官生成以及細胞的增殖、分化、凋亡等活動，絕大多數癌基因或抑癌基因受到miRNAs分子的調控[3-6]。本文采用MTT技術探討miR-34a在骨肉瘤中生物學功能和分子機制，為進一步闡明成骨肉瘤發生發展的分子機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細胞株 人成骨肉瘤MG-63細胞購自上海細胞生物學研究所。

1.1.2 試劑 MTT為Sigma產品，購自北京鼎國生物技術有限公司；miR-34a mimics與inhibitors購自上海吉瑪生物技術有限公司；脂質體Lipo2000購自Invitrogen公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 MG-63細胞用DMEM培養基常規培養，取對數生長期細胞用于實驗。

1.2.2 MTT比色法 為檢測miR-34a對MG-63細胞生長增殖的影響，設計好實驗組與對照組，每組設計重復孔3個，分別在轉染各時間點后每孔加入配置好的MTT溶液20 μL，37℃培養4 h后倒掉培養基，每孔加150 μL二甲亞砜，靜置或輕搖10 min，然后檢測各孔的吸光度值。

1.2.3細胞轉染 消化傳代待細胞增長到70%～80%左右。準備好2.5 μL的脂質體Lipo2000與100 μL無血清MEM培養基充分混勻，然后靜置15～20 min，分別用PBS與無血清MEM培養基洗滌細胞；一起加入96孔板中，然后按說明書操作。

1.3 統計學處理

所有數據均由SPSS 13.0軟件進行處理，兩組間比較采用t檢驗，P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-34a inhibitors對人成骨肉瘤細胞MG-63生長增殖的影響

人成骨肉瘤MG-63細胞經miR-34a inhibitors處理后，細胞生長明顯比未處理細胞的生長迅速；處理1 d、2 d、3 d后經MTT檢測其吸光值，對照組分別為（0.33±0.02）、（0.55±0.03）、（0.75±0.06），處理組分別為（0.41±0.05）、（0.71±0.08）、（0.94±0.08），miR-34a inhibitors處理后均顯著上調，兩組比較差異有統計學意義（t=12.38，P < 0.01）。提示干擾miR-34a可促進人成骨肉瘤細胞MG-63生長增殖的作用。

2.2 miR-34a mimics對人成骨肉瘤細胞MG-63生長增殖的影響

MG-63細胞經miR-34a mimics處理后，MG-63細胞生長明顯比未處理細胞的生長減緩；處理1 d、2 d、3 d后經MTT檢測其吸光值，對照組分別為（0.33±0.02）、（0.55±0.03）、（0.75±0.06），處理組分別為（0.21±0.02）、（0.26±0.03）、（0.31±0.04），處理后均顯著下調，二組比較差異有統計學意義（t = 9.69，P < 0.01）。提示過表達miR-34a可抑制人成骨肉瘤細胞MG-63生長增殖的作用。

3 討論

骨肉瘤是最常見的惡性骨原發腫瘤，發病率約為1/1 000 000～1/100 000，絕大部分的骨肉瘤好發于10～30歲[7]。近年來，隨著影像學的進步，保肢手術、新輔助化療、肺轉移瘤清掃術的綜合應用，骨肉瘤的臨床預后得到了較大的改善[8]。但我們對骨肉瘤生物學功能及發病機制的掌握十分有限，缺乏針對骨肉瘤的特異性治療措施。尤其骨肉瘤的轉移機制不清楚。因此，深入研究骨肉瘤的發生發展具有重要意義。

目前miR-34a在腫瘤中研究如火如荼，是一個“明星miRNA分子”。研究顯示，miR-34a在結直腸癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、膠質瘤等腫瘤組織和細胞中表達下調，且過表達miR-34a抑制多種腫瘤的生長、侵襲與轉移，在腫瘤的發生發展發揮重要作用[9-12]。本研究顯示miR-34a的mimics及inhibitors分別可抑制和促進人成骨肉瘤MG-63細胞生長增殖活性，提示miR-34a可能作為抑癌基因miRNA參與成骨肉瘤的發生發展。同其他腫瘤一樣，骨肉瘤的發生與轉移是一個復雜的生物學問題，是多基因、多因素、環境與遺傳因素相互作用的結果。惡性腫瘤一個重要的生物學特征是其對周圍組織的侵襲和破壞，并在遠隔器官形成轉移灶，腫瘤細胞發展到一定階段，便向周圍傳播，侵蝕正常組織，這種細胞浸潤能力的獲得是腫瘤細胞變成惡性過程中的一個重要環節。miR-34a有調控骨肉瘤細胞的增殖能力，利用miRNA可能成為基因治療骨肉瘤的一個新的研究方向。將有利于闡明miR-34a在骨肉瘤發生、發展中的作用機制，發現潛在的治療靶標和診斷的生物標志物，有望為骨肉瘤的臨床診斷和治療提供新的策略和方法。

[參考文獻]

[1] Tang H，Liu X，Wang Z，et al. Interaction of hsa-miR-381 and glioma suppressor LRRC4 is involved in glioma growth[J]. Brain Res，2011，1390（1）：21-32.

[2] Saini S，Yamamura S，Majid S，et al. MicroRNA-708 induces apoptosis and suppresses tumorigenicity in renal cancer cells[J]. Cancer Res，2011，71（2）：6208-6219.

[3] Srivastava SK，Bhardwaj A，Singh S，et al. MicroRNA-150 directly targets MUC4 and suppresses growth and malignant behavior of pancreatic cancer cells[J]. Carcinogenesis，2011，32（18）：1832-1839.

[4] Ma L，Teruya-Feldstein J，Weinberg RA. Tumour invasion and metastasis initiated by microRNA-10b in breast cancer[J]. Nature，2007，449（7163）：682-688.

[5] Negrini M，Calin GA. Breast cancer metastasis： a microRNA story[J]. Breast Cancer Res，2008，10（2）：203.

[6] Zhu S，Wu H，Wu F，et al. MicroRNA-21 targets tumor suppressor genes in invasion and metastasis[J]. Cell Res，2008，18（3）：350-359.

[7] Meyers PA，Schwartz CL，Krailo MD，et al. Osteosarcoma： the addition of muramyl tripeptide to chemotherapy improves overall survival-a report from the Children’s Oncology Group[J]. J Clin Oncol，2008，26（4）：633-638.

[8] Meyers PA，Schwartz CL，Krailo MD，et al. Osteosarcoma： a randomized， prospective trial of the addition of ifosfamide and/or muramyl tripeptide to cisplatin， doxorubicin， and high-dose methotrexate[J]. J Clin Oncol，2005，23（9）：2004-2011.

[9] Wu J，Wu G，Lv L，et al. MicroRNA-34a inhibits migration and invasion of colon cancer cells via targeting to Fra-1[J]. Carcinogenesis，2012，33（3）：519-528.

[10] Liu C，Kelnar K，Liu B，et al. The microRNA miR-34a inhibits prostate cancer stem cells and metastasis by directly repressing CD44[J]. Nat Med，2011，17（2）：211-215.

[11] Yang P，Li QJ，Feng Y，et al. TGF-β-miR-34a-CCL22 signaling-induced Treg cell recruitment promotes venous metastases of HBV-positive？hepatocellular carcinoma[J]. Cancer Cell，2012，22（3）：291-303.

[12] Guessous F，Zhang Y，Kofman A，et al. microRNA-34a is tumor suppressive in brain tumors and glioma stem cells[J]. Cell Cycle，2010，9（6）：1031-1036.

（收稿日期：2013-04-23）