乳酸乳球菌N3816發酵培養基的優化研究

摘 要：以乳酸乳球菌株（Lactococcus lactis subsp. lactis N3816）為出發菌株，通過單因子試驗和正交設計方法對該菌株產Nisin發酵培養基進行優化。結果表明：該菌株產Nisin的最適碳源、復合氮源和生長因子分別為：蔗糖0.8%、蛋白胨2.0%、酵母膏1.0%、Tween80 1.5%。

關鍵詞：乳鏈球菌肽；培養基；效價

中圖分類號 TS207 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2013）19-34-03

乳鏈球菌肽（Nisin）是乳酸乳球菌的某些菌株在代謝過程中合成的一種具有較強抑菌作用的多肽類細菌素。成熟的乳鏈球菌肽分子含有34個氨基酸殘基，分子量約為3 510 Da，分子式為C143H228N42O37S7。乳鏈球菌肽前分子含有57個氨基酸，前體分子依次經過將部分絲氨酸和蘇氨酸酶促轉化為脫水氨基酸、鏈內形成5個硫醚環、細胞質膜移位和斷裂去除N端23肽而形成[1-3]。

Nisin對引起食品腐敗的絕大部分革蘭氏陽性細菌，特別是對產芽孢的細菌如芽孢桿菌、梭狀芽孢桿菌有很強的抑制作用。另外，Nisin與某些表面活性劑、螯合劑和絡合劑聯合使用時還能抑制部分革蘭氏陰性菌。因此，與其它乳酸菌產生的細菌素相比，Nisin具有較寬的抑菌譜。Nisin屬于天然食品防腐劑的一種，自1951年首次應用于食品保藏以來，Nisin已先后被數10個國家和地區廣泛使用。目前，Nisin應用于乳制品、肉制品、罐裝食品和蛋白食品等的防腐保鮮中，成為越來越受人們重視的一種安全、高效、無毒、天然的食品防腐劑[4]。

隨著Nisin在食品行業中應用的普及，獲得產量較高且生產成本較低的Nisin成為工業化應用的前提。為了提高其產量，人們開始研究一些發酵工藝因素對Nisin發酵生產的影響。本文主要是在實驗室條件下對乳酸乳球菌N 3816進行研究，通過改變碳源、氮源和添加吐溫的方式獲得發酵培養基的最優配比。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 Nisin標準品購于sigma公司。

1.2 菌種 乳鏈菌肽生產菌：乳酸乳球菌（Lactococcus lactis subsp. lactis N 3816），由實驗室保藏。效價檢測指示菌：藤黃微球菌（Micrococcus luteus），購自中國科學院微生物研究所菌種保藏中心。

1.3 培養基 種子培養基：胰蛋白胨1.0g、酵母膏0.3g、葡萄糖0.5g、牛肉膏0.3g、MgSO4·7H2O 0.02g、K2HPO4·3H2O 0.3g、pH6.8，121℃滅菌20min。

發酵培養基：胰蛋白胨1.0g、酵母膏1.0g、蔗糖1.0g、K2HPO4 1.0g、NaCl 0.2、MgSO4·7H2O 0.02g、pH 7.0，121℃滅菌20min。

檢測菌生長培養基：胰蛋白胨0.8g、酵母膏0.5g、葡萄糖0.5g、NaCl 0.5g、Na2HPO4·12H2O 1.0g、pH 6.8，121℃滅菌20min。

檢測效價培養基：胰蛋白胨0.8g、酵母膏0.5g、葡萄糖0.5g、NaCl 0.5g、Na2HPO4·12H2O 1.0g、Tween80 1.0mL、瓊脂1.5g、pH 7.0，121℃滅菌20min。

1.4 試驗方法

1.4.1 發酵培養 將活化的斜面菌種接種于種子培養基中培養24h，以5%的接種量接入發酵培養基中，30℃培養。實驗過程中改變發酵培養基配方，測定發酵液效價。

1.4.2 Nisin標準溶液制備 將Nisin標準樣品（效價

1×106IU/mL）用濃度為0.02mol/L無菌稀鹽酸溶液溶解，配制成濃度為1 000IU/mL的Nisin標準溶液。使用時用0.02mol/L無菌稀鹽酸溶液稀釋成10IU/mL，25IU/mL，50IU/mL，75IU/mL，100IU/mL，250IU/mL，500IU/mL，1 000IU/mL的標準品溶液。

1.4.3 Nisin效價測定 效價檢測采用瓊脂孔擴散法[5]。

1.4.4 單因子試驗 碳源種類和濃度優化試驗：改變發酵培養基中碳源的種類進行發酵培養，測定效價來確定最適碳源類型；改變最適合碳源濃度進行發酵培養，通過測定效價來確定最適合濃度。

氮源種類與濃度的優化試驗：改變發酵培養基中氮源的種類進行發酵培養，測定效價來確定最適氮源類型；改變最適合氮源濃度進行發酵培養，通過測定效價來確定最適合濃度。

Tween80對產Nisin的影響：選取Tween80濃度分別為0.5%、1.0%、1.5%，按上述方法確定適宜的濃度。

1.4.5 正交試驗 根據單因素試驗的結果，對蔗糖、蛋白胨、酵母膏和Tween80用量4個因素，各取3個水平，設計L9（34）正交試驗優化乳酸乳球菌N 3816產Nisin的培養基組成。試驗因子及水平見表l。

由圖2可知，蔗糖濃度過大或過小對Nisin發酵都是不利的，蔗糖濃度在1.0%時對菌體合成Nisin效果最好，為

1 025IU/mL。當蔗糖濃度>1.0%時，菌體合成Nisin有下降趨勢，并且濃度越高下降趨勢越明顯。產生這種現象的原因可能是因為高濃度底物導致滲透壓過高，抑制或影響了菌體的正常生長使得Nisin效價受到影響而明顯下降[7]。

2.2 氮源對Nisin發酵的影響 以發酵培養基為基礎，改變發酵培養基中氮源的種類，各種氮源的添加量都為1%，考察不同氮源對發酵的影響。發酵培養24h后測效價，結果見圖3。

由圖3可見，當氮源為有機氮源時，乳酸乳球菌N3816的生長明顯優于無機氮源，復合氮源的發酵效果最好。復合氮源能為菌體生長和Nisin合成提供一個較為合理的有機氮源配比，有利于微生物的生長與合成代謝；同時，多種氮源復配有利于降低培養基成本，對工業化生產也十分有益。

2.3 Tween80對Nisin發酵的影響 以發酵培養基為基礎，向起始發酵液中分別加入0%、0.50%、1.00%和1.50%（v/v）的Tween80，發酵培養24h后測效價，結果見圖4。 （下轉87頁）

圖4為不同Tween80添加量對乳酸乳球菌N3816發酵過程中Nisin產量的影響。由圖4可知，各濃度的Tween80對Nisin的合成都有促進作用，并且Tween80的濃度越大Nisin產量提高越多。根據文獻報道，Tween80對Nisin合成的促進作用主要是通過降低菌種與培養基的表面張力，增加了細胞胞外酶的合成；同時，改善了細胞的膜透性，提高營養物質的吸收和Nisin在胞內的合成。另外也有研究專家學者認為，Tween80的影響是由于其減慢了Nisin失活速率[8-9]。

2.4 正交試驗結果與分析 采用正交試驗，對乳酸乳球菌N3816產Nisin的發酵培養基組成進行了優化，正交試驗結果見表2。

3 結論

本研究表明Nisin的生物合成的最佳碳源是蔗糖，胰蛋白胨和酵母膏為其最佳有機氮源組合。經過正交試驗方法優化得出乳酸乳球菌N3816發酵產Nisin的最佳發酵條件：蔗糖0.8%、蛋白胨2.0%、酵母膏1.0%、吐溫1.5%。在優化條件下經3批發酵培養Nisin的效價最高可達3 580IU/mL。

參考文獻

[1]吳瓊，李晶，黃海燕.乳酸鏈球菌與化學防腐劑抑菌效果比較[J].食品研究與開發，1999，20（1）：44-46.

[2]郭本恒.Nisin產品及影響產品活性的因素[J].中圍畜產與食品，2000，7（6）：263-265.

[3]吳兆亮，宮立鵬，趙艷麗，等.乳鏈菌肽發酵工藝的研究[J].化學反應工程與工藝，2006，22（4）： 377-380.

[4]王立國.乳酸鏈球菌素（Nisin）在食品中的應用 [J].食品研究與開發，2008，29（10）：177-180.

[5]吳瓊.乳鏈菌肽效價測定方法的研究[J].食品科學，1999，5（6）：56-59.

[6]莊緒亮，張洪勛，馬桂榮，等.乳酸菌肽發酵的主要影響因子[J].化工冶金，2000，21（1）：93-97.

[7]盧金珍，趙為，任俊.乳鏈菌肽（Nisin）發酵培養基的優化[J].食品研究與開發，2010，4（5）：122-126.

[8]Degnan A J，Buyong N，Luchansky J B. Antilisterial activity of pediocin AcH in model food systems in the presence of an emulsifier or encapsulated within liposomes[J].Int J Food Microbiol，1993，18（2）： 127-138.

[9]Bhatti M，Veeramachaneni A，Shelef L A. Factors affecting the antilisterial effects of nisin in milk[J]. Int J Food Microbiol，2004，97（2）： 215-219.

（責編：施婷婷）