擬步甲部分種核基因18SrDNA序列及分子系統學研究

摘 要：擬步甲（Tenebrionidae）是鞘翅目的一個較大的類群，全球已知12個亞科100多族1 500多屬約25 000種，我國已知9亞科45族280余屬近1 300種。實驗利用18SrDNA基因片段序列對擬步甲科的部分種進行系統發育分析，并對靶序列進行排序、比較、分析，計算核苷酸組成、變異位點和DNA序列差異，構建了分子系統進化樹（NJ，ME），確定各類群間的系統關系，驗證了宏觀形態分類學。

關鍵詞：擬步甲科；核18SrDNA；DNA序列；分子系統學

中圖分類號 S435.622 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2013）19-25-03

在依據外部形態分類鑒定及相關學者工作的基礎上，以擬步甲科的部分種類為研究對象，利用PCR技術通過對擬步甲科部分種類核18SrDNA基因序列的研究，探討擬步甲科不同族之間、不同種之間的DNA分子的差異，研究選擇類群的分類地位和親緣關系，為豐富擬步甲科的分子系統學研究，進一步完善擬步甲科的分類系統，揭示其系統發育和演化提供分子水平的依據。

1 材料與方法

1.1 材料 選用擬步甲6個族中的9種進行實驗，所用的昆蟲標本采自寧夏（中衛、賀蘭山、固原、中寧等縣市）。材料來源及代號具體如表1所示。

1.2 實驗方法

1.2.1 基因組DNA的提取采用SDS-蛋白酶消化法提取昆蟲的DNA，該方法參考印紅[1]、代金霞[2]、樸美花[3]、張大治[4]、張迎春[5]、田英芳[6]等的方法并加以改進。即從100%的無水酒精中取出樣本，用滅菌過的小剪刀將其腿部剪開，取出其腿部肌肉，濾紙吸干，研磨，用SDS/蛋白酶K消化液消化5h左右。用常規的酚/氯仿抽提法（酚∶氯仿∶異戊醇=25∶24∶1）提取基因DNA，乙醇促沉淀后溶解在48μL無菌水中，置-20℃環境備用。

1.2.2 PCR擴增反應體系（48μL） PCR擴增反應體系48μL，含10×Buffer緩沖液5μL，25mmol/L MgCl2 4μL，雙蒸水29.45μL，引物各3μL，Taq酶0.3μL，dNTP（10mmol/L）1.25μL，模板2μL。

1.2.3 PCR擴增反應條件 PCR擴增反應條件如下（每樣品的擴增（PCR）體積為48μL）：預變性：94℃，8min；每一次循環包括：94℃變性30s，45～50℃退火1min，72℃延伸70s，72℃延伸10min。共35個循環。

1.2.4 瓊脂糖凝膠電泳法 產物采用瓊脂膠進行平板電泳，即稱取瓊脂糖和0.5倍TBE緩沖液倒入到三角錐瓶，微波爐高溫加熱到膠體透亮拿出，冷卻，膠體中加入10mg/mL的EB儲存液1.5～2.5μL。電泳孔向負極（緩沖液的液面離膠面約0.5mm），取已提取的DNA樣品6μL點樣，用2.5μL緩沖液（0.25%溴酚蘭+40%蔗糖），在60～80V的電壓下電泳，待溴酚藍離正極膠端約1.4cm處停止，放于紫外檢測儀下觀察，結果有亮帶，說明總DNA已存在，照相記錄。

1.2.5 DNA序列數據的處理和分子系統樹的構建 將實驗測定的9種擬步甲的18SrDNA序列和從GenBank中查詢到的7種擬步甲的同源序列用Clustal X1.83軟件詳細比對，加以人工校對。用MEGA4.0軟件計算堿基組成、不同位點轉換和顛換平均值、種間的遺傳距離等。用MEGA軟件的ME法和NJ法分別構建分子系統樹研究擬步甲科的系統發育關系。在構建系統發生樹時，以一種芫菁Meloe proscarabaeus作為外類群（表2），同時應用自引導分析（bootstrapping）估計系統樹中節點的自引導值。

3 討論

真核生物的染色體上編碼核糖體小亞基RNA的基因稱為18SrDNA，由于18SrRNA基因在蛋白質合成中具有重要的功能，因此其基因序列及二級結構高度保守，一般認為它比較適合于研究高級階元的系統發育[3]。印紅[1]用核糖體18SrDNA全序列構建了蝗總科分子系統樹上錐頭蝗科和瘤錐蝗科的種類聚在了一起。王瑛[7]對棉鈴蟲18S核糖體RNA基因的序列及其分子系統學進行了分析。

從密碼子不同位點的核苷酸頻率及C+G含量表發現，4種堿基的含量相差不大；這與擬步甲科線粒體16SrDNA基因序列含有較高比例的A和T，而G和C含量較少[9]明顯不同。18SrDNA的堿基組成無偏異，認為本研究的系統發育結果受堿基組成偏異的影響甚微或不受影響。而且在所測序列中，C+G的平均含量為53.0%，略高于A+T的平均含量47.0%。這與Hendriks等的研究結果甲蟲18SrDNA基因序列的G+C含量為52%相接近。本研究的轉換和顛換比平均值為2.3，大于2.0。因此認為18SrDNA對擬步甲科重建系統發生樹受飽和狀態的影響較小，構建分子系統樹時不需要對轉換和顛換進行特別加權。

利用MEGA4.0軟件對所選11種擬步甲昆蟲成對序列間未校正的P距離進行分析。其中縊脛琵甲和異形琵甲遺傳距離最小，為0.001，表現出較近的親緣關系。用Kimure-二參數法校正后平均遺傳距離僅為0.009，得所選物種間18SrDNA序列分歧也不大，說明18SrDNA基因序列在擬步甲不同族級單元具有很高的同源性。

用ME法和NJ法分別構建系統發生樹，得朽木甲亞科的異角櫛甲明顯與擬步甲支系首先分離，構成一單系群。這與劉曉麗[8]構建的分子系統樹（朽木甲類最早從擬步甲科中分歧出來，說明它是一個較原始的單系類群，建議恢復其原有的科級地位）的觀點相同；鱉甲族、硯甲族、漠甲族聚在一起，與Watt[9]在其分類系統中將它們安排在漠甲亞科Pimeliinae的觀點相同；琵甲和刺甲聚在一起，支持分類系統中將它們安排在擬步甲亞科Tenebrioninae的傳統觀點；土甲族和墊甲族的昆蟲聚在一起，支持了劉曉麗線粒體16SrDNA基因序列研究得出的土甲族和墊甲族具有較近親緣關系的結論。

Watt分類系統中的擬步甲亞科的8族昆蟲分成2個獨立的進化支，與其生物學特性相一致，即樹棲種類和土棲種類分別聚為一支。在系統樹中擬步甲亞科Tenebrioninae的幾個族未能優先聚集，原因可能是不屬于一個單系的成分混雜于一個亞科內。

18SrDNA基因序列的分析結果與Watt分類系統大體相吻合。本文雖然選取的種類較少，但在一定程度上說明將18SrDNA基因序列作為遺傳標記運用于擬步甲科較高階元的分類研究是值得考慮的方法之一。在擬步甲科研究中應盡量多的選擇具有廣泛代表性的種類進行系統學研究，希望能更深入的揭示族間系統演化關系。

參考文獻

[1]印紅，李新江，王文強，等.基于核內核糖體小亞基序列的蝗總科系統發育關系分析[J].昆蟲學報，2004，47（6）：809-814.

[2]代金霞，于有志，鄭哲民.擬步甲昆蟲基因組DNA提取的比較研究[J].寧夏大學學報，2004，25（1）：66-67.

[3]樸美花，陳學新，何俊華.膜翅目昆蟲干標本的基因組DNA提取[J].動物分類學報，2002，27（4）：672-676.

[4]張大治.蜻蜓目差翅亞目部分種類線粒體Cytb基因序列及分子系統學研究[D].西安：陜西師范大學，2004.

[5]張迎春，劉波，鄭哲民，等.不同保藏處理的昆蟲標本DNA提取及其隨機擴增多態DNA反應[J].昆蟲學報，2002，45（5）：639-695.

[6]田英芳，黃剛，鄭哲民.一種簡易的昆蟲基因組DNA提取方法[J].陜西師范大學學報：自然科學版，1999，27（4）：82.

[7]王瑛，陳曉峰，劉偉，等.棉鈴蟲18S核糖體RNA基因的序列分析及其分子系統學[J].昆蟲學報，1999，42（3）： 241-247.

[8]劉曉麗.部分擬步甲線粒體16SrDNA和18SrDNA基因序列與分子系統學研究[D].保定：河北大學，2004.

[9]Watt J C. A revised subfamily classification of Tenebrionidae（Coleoptera）[J].New Zealand Jour.Zool.，1974，1：381-452.

（責編：施婷婷）