棕色棉發育期兒茶素的HPLC分析

摘 要：以棕色棉和白色棉為材料，利用HPLC法測定發育期種皮與纖維中兒茶素的組分與變化規律。結果表明：棉鈴發育期，深棕ANL-1和泗棉3號種皮中有兒茶素單體EGC、C、EC，纖維中有GC、C。深棕ANL-1種皮中主要組分C的含量高于泗棉3號，且在28～35DPA階段迅速下降。深棕ANL-1纖維中GC和C的含量均表現出先升后降的趨勢。泗棉3號發育期纖維中各兒茶素組分含量水平非常低。初步推斷在纖維伸長期，兒茶素等棕色素前體不斷合成并積累，并在次生壁沉積期被逐漸氧化消耗而形成有色的棕色素。

關鍵詞：棉花；高效液相色譜法；兒茶素；縮合單寧

中圖分類號 S562 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2013）19-21-03

詹少華[1]利用純化色素進行化學性質鑒定、波譜測定以及生理學指標分析，推斷天然棕色棉纖維色素為單寧類氧化而來的醌類化合物，并根據前人生物合成途徑的研究成果，總結和推斷縮合單寧是通過莽草酸途徑合成的兒茶素的聚合體。Ryser[2]通過薄層層析等試驗方法，在棕色棉短絨里發現了單寧的前體兒茶素及單寧的衍生物，同時推測棕色纖維的顏色可能與位于液泡里的由兒茶素衍化的單寧作用有關，這正好驗證了詹少華[1]的工作。但棕色棉與白色棉種皮與纖維發育期兒茶素單體成分及含量的變化規律如何，兒茶素與棕色素合成關系等報道較少。對于這些方面的研究將有助于我們進一步了解棕色棉纖維色素的合成機理。

筆者通過高效液相色譜法（HPLC）定性和定量測定了棕色棉和白色棉發育期種皮和纖維中兒茶素單體成分及含量變化，比較不同棉種中縮合單寧前體兒茶素的差異，以期為深入探討棕色棉色素的合成機制提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 以安徽農業大學生物物理實驗室選育的品系深棕色棉“ANL-1”和白色棉“泗棉3號”為實驗材料，于2012年5月種植于安徽農業大學農業園區內，常規管理，開花期選擇發育正常、無病蟲害植株的中上部果枝，上午9∶00～11∶00對當日花進行掛牌，每隔7d取棉鈴，-70℃保存。

1.2 實驗方法

1.2.1 兒茶素的提取 采用乙醇提取法[3]，分別取0.8g種皮與纖維，加少許石英砂和3mL 95%的乙醇研磨至勻漿狀，5 000rpm離心10min，吸取上清，沉淀加3mL 95%的乙醇，再次離心。此法重復3次，最后95%的乙醇定容至10mL。加2倍體積水后，2倍體積乙酸乙酯萃取2次兒茶素。收集乙酸乙酯并在70℃左右減壓干燥，得兒茶素粗品。色譜甲醇溶解并定容至1mL，稀釋2倍，過有機濾頭，進樣。

1.2.2 兒茶素的HPLC分析及含量計算 幾種兒茶素的組分采用高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）進行測定。色譜條件：色譜泵：Waters 600；控制儀：Waters 600；色譜柱：Phenomenex Synergi 4u Fusion 250×4.6mm；檢測器：UV Waters 2487；靈敏度：0.01；檢測波長：280nm；流速：1.2mL/min；進樣量：5μL；每一試樣進樣之前，以流動相平衡15min。采用梯度洗脫條件A相：1%乙酸，B相：色譜純乙腈，保留時間40min。洗脫具體條件見表1。

2 結果與分析

2.1 兒茶素的HPLC檢測分析 分別取28DPA時的深棕ANL-1的種皮與纖維，以泗棉3號為對照，HPLC定性檢測其中兒茶素單體成分，檢測結果如圖1～4所示，以標樣色譜（圖5）為參照：深棕ANL-1種皮中檢測出EGC、C、EC，出峰時間分別在7.794min、9.22min、13.359min，峰面積為3 546、522 704、18 567。泗棉3號種皮中檢測出EGC、C、EC，出峰時間分別在7.864min、9.305min、13.470min，峰面積為20 643、440 708、15 104。深棕ANL-1纖維中檢測出GC、C，出峰時間在5.367min和9.272min，峰面積分別為20 316和19 449。泗棉3號纖維中檢測出GC、C，出峰時間為5.395min和9.230min，峰面積為6 409和54 944。其他兒茶素單體成分難以檢測到。故初步推斷深棕ANL-1和泗棉3號種皮發育期兒茶素單體成分為EGC、C、EC，其纖維發育期兒茶素單體成分為GC和C。

3 結論與討論

通過高效液相色譜的檢測，分別發現了在棕色棉和白色棉發育期的種皮與纖維中存在著不同組分的兒茶素。這恰好與Ryser[2]的研究結果吻合，并進一步驗證了詹少華[1]的工作。深棕ANL-1種皮中主要組分C的含量高于泗棉3號，且在28～35DPA階段迅速下降，這與其所對應的縮合單寧含量的變化規律相似，說明在該時期兒茶素衍化成縮合單寧，并被消耗氧化形成醌類物質。同時，泗棉3號發育期纖維中各兒茶素組分含量水平非常低，表明白色棉發育期纖維中兒茶素聚合形成的縮合單寧含量少，棕色素前體合成少。深棕ANL-1纖維中GC和C的含量均表現出先升后降的趨勢，初步推斷在纖維伸長期（0～25DPA），由兒茶素衍化生成的單寧類物質等棕色素前體不斷合成并積累，并在次生壁沉積期（25～45DPA）被逐漸氧化消耗而形成有色的棕色素。

參考文獻

[1]詹少華，林毅，蔡永萍，等. 縮合單寧與天然棕色棉纖維色素合成的關系[J]. 棉花學報，2007，9（3）： 183-188.

[2]Ryser U. Cell wall growth in elongating cotton fibers： an autoradiographic study[J]. Cytobiology，1980，15： 78-84.

[3]Kitakawa N S，Takeishi J，Yonemoto T. Improvement of Catechin Productivity in Suspension Cultures of Tea Callus Cells[J]. Biotechnol.Prog. 2003，19： 655-658.

[4]董合忠，李維江，唐薇，等. 彩色棉纖維發育與色素形成[J]. 中國棉花，2004，31（2）： 2-4.

[5]胡超，楊園園，郭寧，等. 棕色棉和白色棉縮合單寧單體兒茶素動態變化比較[J]. 植物生理學報，2011，47 （7）： 685-690.

（責編：徐世紅）