酶聯免疫吸附分析實驗在食品分析教學中的實施

摘 要：該文通過對酶聯免疫吸附分析（ELISA）實驗在食品分析教學中實施情況進行探討。介紹了該實驗的基本原理以及實施過程，并以在食品安全檢測領域中較常用的競爭ELISA為例，論述了用ELISA檢測食品中有害小分子化學物質的實驗步驟。為有關院校開展ELISA實驗提供指導和借鑒。

關鍵詞：酶聯免疫吸附分析 綜合性實驗 教學

中圖分類號：G421文獻標識碼：A文章編號：1674-098X（2013）05（a）-0149-02

食品分析是食品科學與工程專業重要的專業基礎課程之一。食品分析實驗課是食品分析教學的重要組成，是鍛煉學生實驗操作能力，分析解決問題能力的重要教學途徑之一。酶聯免疫吸附分析（ELISA）技術涉及有機化學、食品化學、生物化學和免疫學等綜合知識內容，在食品分析學中開展ELISA綜合性實驗，不僅利于提高教學質量，而且能鍛煉學生綜合技能運用能力。

1 ELISA綜合實驗在教學中開展的意義

酶聯免疫吸附分析技術是一種固相免疫分析方法，因其具有靈敏、快速、特異性強等特點，迅速發展，在食品安全檢測領域應用越來越廣泛，成為食品中小分子有害因子主要的快速篩查技術手段[1]。目前，對于食品中的農藥、獸藥殘留，生物毒素，致病微生物等有害物質的分析，市面上已有商品化的ELISA試劑盒[2]。但本科教學極少開展ELISA教學，學生對其原理和操作了解較少，缺乏實驗機會，相關知識的理解主要停留在理論教學水平。在食品專業開設ELISA實驗課程，已成為一項非常必要的實驗教學內容。有助于幫助學生學習對相關知識點的學習及掌握，提高學生對生物分析技術的認識，了解免疫分析技術在食品安全領域應用的優勢及重要性，并鍛煉學生動手能力，培養學生的綜合素質。

2 ELISA實驗的原理

ELISA技術是用酶標記的抗原或酶標記的抗體為主要試劑，通過復合物中的酶催化底物呈色反應來對被測物進行定性或定量的一種免疫分析方法[3]。其原理是把抗原或抗體結合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性，在測定時，將受檢樣品（測定其中的抗體或抗原）和酶標抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應，形成抗原抗體復合物，用洗滌的方法使固相載體上的抗原抗體復合物與其他物質分開，最后結合在固相載體上的酶量與樣品中受檢物質的量成一定的比例。加入酶反應的底物后，底物被酶催化變為有色產物，通過定性或定量分析有色產物即可確定樣品中待測物質的含量[4-5]。目前ELISA 的分類方法眾多，主要技術類型有雙抗體夾心法、間接法、捕獲法、競爭法。在食品安全檢測領域，競爭法為主要類型[6]。檢測原理示意圖見圖1。

3 實施過程及具體實驗步驟

根據筆者的教學經驗，該綜合性實驗約需教學時數，10～12學時，具體操作過程如下。

（1）帶教老師講述ELISA的原理，應用及注意事項。

（2）通過觀看酶聯免疫吸附實驗操作視頻，了解整個實驗流程及操作要點。

（3）將學生分組，每組3人，開展ELISA綜合實驗。

（4）實驗操作結束，帶教老師與學生共同討論分析實驗結果。

具體的實驗操作步驟如下：

以測定牛奶和魚肉中的氯霉素為例，采用酶標抗原的直接競爭法，介紹本實驗具體實驗步驟。

（1）包板：將抗體用包被液稀釋一定的倍數，加入96孔酶標板中，100 μL/孔。37 ℃孵育，過夜。

（2）封板：洗板兩次，加入封閉液120 μL/孔，37 ℃孵育，3小時。

（3）樣品前處理：封板時，分別對樣品牛奶和雞肉進行前處理。

（4）烘干：將封閉好的板倒掉封閉液，37℃烘干。

（5）加樣：加標準品/樣本50 μL/孔，然后加入酶標記物50 μL/孔，再振蕩混勻，用封板膜蓋板，37 ℃條件下反應30 min。

（6）顯色：洗板4～5次，每次浸泡30s，拍干。每孔加入底物緩沖液50 μL，再加底物液50 μL，輕輕振蕩混勻，37 ℃或室溫環境避光顯色10 min。

（7）測定：每孔加入終止液50 μL，輕輕振蕩勻，設定酶標儀于450 nm處測定吸光度值。

（8）結果判定：以標準品百分吸光率為縱坐標，以氯霉素標準品濃度（ng/mL）的半對數為橫坐標，繪制標準曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中氯霉素實際濃度。

4 結語

ELISA實驗是一個綜合性實驗，涉及到有機化學，食品化學，生物化學以及免疫學等方面的相關知識。因此，學生通過本實驗，可以取得以下效果：（1）鞏固理論知識，加強對相關知識的理解，并對該技術在食品安全檢測領域的重要性有一定的認識。（2）結合視頻及具體實驗操作，了解整個實驗的操作流程。（3）學生之間分組進行實驗，加強相互協作及團隊意識。

在食品科學與工程、食品營養、食品質量與安全、生物工程等專業的食品分析實驗課中，我們為部分同學開設了ELISA綜合實驗，檢測過的對象包括氯霉素、鹽酸克倫特羅、三聚氰胺、和孔雀石綠等。本實驗內容豐富充實，實驗現象生動有趣，深受學生的歡迎。

參考文獻

[1]何紫薇，郭琦.酶聯免疫吸附（ELISA）技術在食品檢驗的發展應用[J].生物科技與醫藥衛生，2011（11）：71-72.

[2]李明堯.酶聯免疫吸附（ELISA）技術在食品檢驗的發展應用[J].中國醫藥指南，2012，10（35）：380-381.

[3]王守法，闞春月，許學書.酶聯免疫吸附試驗在食品檢測中的應用[J].食品科學，2009，30（23）：489-492.

[4]孫太凡.酶聯免疫吸附分析技術在農藥殘留分析中的應用[J].安徽農業科學，2010，38（22）：11981-11983.

[5]Yu-Dong Shen， Xing-Fei Deng， Zhen-Lin Xu，et al. Simultaneous determination of malachite green，brilliant green and crystal violet in grass carp tissues by a broad-specificity indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay[J].Analytica Chimica Acta， 2011，707（1/2）：148-154.

[6]張占軍，王富花.酶聯免疫吸附技術及其在食品安全檢測中的應用[J].食品研究與開發，2011，32（1）：157-159.