羅格列酮對RAW 264.7 細胞源性泡沫細胞炎癥反應及SOCS1 和SOCS3 表達的影響*

李 飛， 袁 勇， 董吁鋼， 董劍廷， 馮 力， 鄧志華

(1中山市人民醫院心血管內科，廣東 中山528400;2中山大學附屬第一醫院心血管內科，廣東 廣州510080)

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是一種炎癥性疾病［1］。其中促炎/抗炎細胞因子的平衡在AS 的形成以及粥樣斑塊的穩定中起著重要作用。細胞因子在動脈粥樣硬化中的表達量高于在正常動脈中的表達，并且促炎細胞因子腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、白細胞介素6(interleukin-6，IL-6)含量高于抗炎細胞因子白細胞介素10(interleukin-10，IL-10)［2］。這些研究提示，促炎細胞因子信號的負向調控機制可能在抑制斑塊的進展中起著重要作用。細胞因子信號抑制物(suppressors of cytokine signaling，SOCS)是一系列能夠抑制細胞因子信號轉導的蛋白。近來發現，SOCS 蛋白家族與AS有著密切關系。人的動脈粥樣硬化斑塊中巨噬細胞及血管平滑肌細胞中有SOCS1 及SOCS3 的高表達，且在斑塊炎癥活躍的肩部比纖維化區表達量要多。反義寡核苷酸技術靶向下調ApoE 基因敲除小鼠的SOCS3 基因表達，可通過增加斑塊體積、白細胞募集及趨化因子表達，促進斑塊的形成［3］。因此，以SOCS 蛋白為靶點，上調SOCS1 和SOCS3 的表達，減少促炎細胞因子的生成，可能成為防治AS 的新策略。過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator-activated receptors，PPARs)屬于核受體超家族轉錄因子。研究表明，PPARγ 的激活能夠抑制動脈粥樣硬化的形成［4］。然而PPARγ 活化對泡沫細胞SOCS 表達有何影響，尚缺乏充分研究，本研究旨在觀察PPARγ 激動劑羅格列酮對RAW 264.7 細胞源性泡沫細胞促炎/抗炎反應以及SOCS1 和SOCS3表達的影響。

材 料 和 方 法

1 材料

小鼠單核-巨噬細胞株RAW 264.7 購自武漢大學中國典型培養物保藏中心。氧化型低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL)購自中國醫學科學院基礎醫學研究所生化所。羅格列酮購自Cayman。DMEM 培養基購自Gibco。新生小牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)購自廣州威佳科技有限公司。TNF-α、IL-6 及IL-10 ELISA 試劑盒購自晶美生物工程有限公司(最低檢測標準4 ng/L)。小鼠SOCS1 及SOCS3 單克隆抗體購自MBL。

2 細胞培養

RAW264. 7 細胞培養于含10% 小牛血清的DMEM 培養基中，培養條件為37 ℃、95%空氣，5%CO2。每隔2 ～3 d 更換1 次培養液。取對數生長期細胞進行實驗，實驗前用倒置顯微鏡觀察，形態良好，折光性強。細胞密度調至2 ×108/L，24 h 后換成含0.1%小牛血清的DMEM 培養基培養，次日更換1次培養液，加入ox-LDL(100 mg/L)培養24 h 后加入羅格列酮(20 μmol/L)。

3 RT-PCR 檢測SOCS1 及SOCS3 mRNA 的表達

實驗分組及分別在加入羅格列酮6 h、12 h、24 h后加入TRIzol Reagent 提取細胞總RNA，經紫外分光光度計檢測純度和濃度。符合要求的總RNA 用反轉錄試劑盒合成cDNA 第一鏈，以合成的cDNA 為模板，小鼠GAPDH 為內參照，小鼠SOCS1 及SOCS3上、下游引物行PCR 檢測。引物由TaKaRa 公司合成，序列:SOCS1 正義鏈5’-AGTAGGATGGTAGCACGCAAC-3’，反義鏈5’-AAGGAACTCAGGTAGTCACGG-3’;SOCS3 正義鏈5’-ACTTCACGGCTGCCAACATC-3’，反義鏈5’-GGATGCGTAGGTTCTTGGTC-3’;GAPDH 正 義 鏈5’-TAGCCCAGGATGCCCTTTAGT-3’，反義鏈5’-CCCCCAATGTATCCGTTGTG-3’。反應體系為50 μL，反應條件:95 ℃5 min預變性，94 ℃30 s，退火(SOCS1:60 ℃;SOCS3:59℃;GAPDH:55 ℃)30 s，72 ℃1 min，40 個循環，72℃7 min。取PCR 擴增產物5 μL 行瓊脂糖凝膠電泳分析，以GAPDH 作內參照，計算相對單位。

4 Western blotting 檢測各組SOCS1 及SOCS3 蛋白質的水平

實驗分組及分別在加入羅格列酮6 h、12 h、24 h后提取細胞總蛋白:棄去藥物，用預泠的PBS 潤洗細胞后，倒盡吸干PBS，加入RIPA 裂解液，冰上裂解30 min，刮下細胞，離心，取上清液于-80 ℃保存。提取細胞總蛋白后經Mini BCA 法定量。十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和免疫印跡雜交:各取12 μL 提取液，100 ℃變性5 min，上樣，電泳，轉膜后封閉，加入Ⅰ抗(SOCS1 及SOCS3 抗體濃度1.5 mg/L)4 ℃過夜，洗膜，加入Ⅱ抗(0.5 g/L)于室溫下作用2 h，洗膜后進行化學發光，顯影。根據各條帶密度的變化，判斷SOCS1 及SOCS3 蛋白質的表達情況。

5 培養液中TNF-α、IL-6 及IL-10 濃度測定

實驗分組及加入羅格列酮24 h 后，ELISA 法檢測各組培養液中TNF-α、IL-6 及IL-10 的含量。操作步驟按試劑盒說明書進行測得各組的A 值。以標準品濃度和相應的A 值為參數，用SPSS 10.0 統計軟件進行直線回歸處理，得出相應的方程;把各標本的A值代入方程算出各標本中上述細胞因子的濃度。

6 統計學處理

結 果

1 羅格列酮對小鼠RAW 264.7 細胞源性泡沫細胞分泌TNF-α、IL-6 及IL-10 的影響

如表1 所示，ox-LDL(100 mg/L)組培養液中TNF-α、IL-6 及IL-10 的濃度均明顯高于control 組(P ＜0.05)。而加入羅格列酮(20 μmol/L)24 h 后細胞培養液中TNF-α、IL-6 及IL-10 的濃度均明顯低于ox-LDL 組(P ＜0.05)。

表1 各組培養液中TNF-α、IL-6 及IL-10 的濃度Table 1. The concentrations of TNF-α，IL-6 and IL-10 in supernatants in various groups (ng/L. ±s.n=6)

表1 各組培養液中TNF-α、IL-6 及IL-10 的濃度Table 1. The concentrations of TNF-α，IL-6 and IL-10 in supernatants in various groups (ng/L. ±s.n=6)

ROZ:rosiglitazone* P ＜0.05 vs control;#P ＜0.05 vs ox-LDL.

Group TNF-α IL-6 IL-10 Control 21.17±10.31 16.52±7.00 18.75±8.22 ox-LDL 152.22±49.20* 55.53±10.65* 48.63±10.37*ox-LDL+ROZ 38.32±17.98# 26.75±7.97# 30.16±8.71#

2 各組培養上清液TNF-α/IL-10 及IL-6/IL-10 比值變化

如表2 所示，ox-LDL 組TNF-α/IL-10 及IL-6/IL-10 的比值明顯高于control 組。而加入羅格列酮24 h 后，TNF-α/IL-10 及IL-6/IL-10 的比值明顯低于ox-LDL 組(P ＜0.05)。

表2 各組培養液中TNF-α/IL-10 和IL-6/IL-10 比值Table 2. TNF-α /IL-10 and IL-6/IL-10 ratios in supernatants in various groups (±s.n=6)

表2 各組培養液中TNF-α/IL-10 和IL-6/IL-10 比值Table 2. TNF-α /IL-10 and IL-6/IL-10 ratios in supernatants in various groups (±s.n=6)

ROZ:rosiglitazone. * P ＜0. 05 vs control;#P ＜0. 05 vs ox-LDL.

Group TNF-α/IL-10 IL-6/IL-10 Control 1.10 ±0.21 0.88 ±0.08 ox-LDL 3.07 ±0.40* 1.15 ±0.07*ox-LDL+ROZ 1.23 ±0.25# 0.89 ±0.06#

3 羅格列酮對RAW 264. 7 細胞源性泡沫細胞SOCS1 和SOCS3 mRNA 表達的影響

如圖1、2 及表3 所示，control 組與ox-LDL 組只有少量SOCS1 和SOCS3 mRNA 的表達，且二者之間SOCS1 和SOCS3 mRNA 的表達無明顯差別。而LPS(1 mg/L)作用于泡沫細胞6 h 及羅格列酮作用于泡沫細胞6 h、12 h 后SOCS1 和SOCS3 mRNA 表達均明顯高于control 組與ox-LDL 組(P ＜0.05)，24 h 后SOCS1 和SOCS3 mRNA 的表達與control 組及ox-LDL 組無明顯差異(P ＞0.05)。

Figure 1. SOCS1 mRNA expression in foam cells in different groups detected by RT-PCR. Foam cells were treated with 100 mg/L ox-LDL or 1 mg/L LPS for 6 h，or 20 μmol/L rosiglitazone (ROZ)for 6 h，12 h or 24 h.圖1 各組泡沫細胞SOCS1 mRNA 的表達

Figure 2. SOCS3 mRNA expressions in foam cells in different groups detected by RT-PCR. Foam cells were treated with 100 mg/L ox-LDL or 1 mg/L LPS for 6 h or 20 μmol/L rosiglitaqzone (ROZ)for 6 h，12 h or 24 h.圖2 各組泡沫細胞SOCS3 mRNA 的表達

表3 各組泡沫細胞SOCS1 和SOCS3 mRNA 的表達Table 3. SOCS1 and SOCS3 mRNA expression in foam cells in different groups (±s.n=3)

表3 各組泡沫細胞SOCS1 和SOCS3 mRNA 的表達Table 3. SOCS1 and SOCS3 mRNA expression in foam cells in different groups (±s.n=3)

The levels of mRNA were expressed as ratios to GAPDH.ROZ:rosiglitazone. * P ＜0.05 vs control or ox-LDL.

Group SOCS1 SOCS3 Control 0.18 ±0.03 0.15 ±0.03 ox-LDL 0.30 ±0.04 0.34 ±0.06 LPS 2.95 ±0.34* 1.57 ±0.21*ox-LDL+ROZ(6 h) 2.41 ±0.25* 2.90 ±0.32*ox-LDL+ROZ(12 h) 1.60 ±0.27* 2.42 ±0.37*ox-LDL+ROZ(24 h)0.21 ±0.06 0.44 ±0.15

4 Western blotting 法觀察RAW264.7 源性泡沫細胞SOCS1 和SOCS3 蛋白的表達

如圖3、4 及表4 所示，control 組與ox-LDL 組只有少量SOCS1 和SOCS3 蛋白的表達，且兩組之間無明顯差別。LPS 作用于泡沫細胞6 h 及羅格列酮作用于泡沫細胞6 h、12 h、24 h 后SOCS1 和SOCS3 蛋白的表達均明顯高于control 組與ox-LDL 組(P ＜0.05)。

Figure 3. SOCS1 protein expression in foam cells in different groups detected by Western blotting. Foam cells were treated with 1 mg/L LPS or 100 mg/L ox-LDL for 6 h，or 20 μmol/L rosiglitazone for 6 h，12 h or 24 h.1:control;2:LPS;3 ～5:ox-LDL+rosiglitazone for 6 h，12 h and 24 h;6:ox-LDL.圖3 各組泡沫細胞SOCS1 蛋白的表達

Figure 4. SOCS3 protein expressions in foam cells in different groups.1:control;2:LPS;3 ～5:ox-LDL+ rosiglitazone for 6 h，12 h and 24 h;6:ox-LDL.圖4 各組泡沫細胞SOCS3 蛋白的表達

表4 各組泡沫細胞SOCS1 和SOCS3 蛋白的表達Table 4. SOCS1 and SOCS3 protein expression in foam cells in different groups (±s.n=3)

表4 各組泡沫細胞SOCS1 和SOCS3 蛋白的表達Table 4. SOCS1 and SOCS3 protein expression in foam cells in different groups (±s.n=3)

The levels of proteins were expressed as ratios to β-actin.ROZ:rosiglitazone. * P ＜0.05 vs control or ox-LDL.

Group SOCS1 SOCS3 Control 0.18 ±0.06 0.15 ±0.06 ox-LDL 0.18 ±0.04 0.09 ±0.05 LPS 1.39 ±0.20* 1.68 ±0.24*ox-LDL+ROZ(6 h) 0.63 ±0.11* 1.20 ±0.13*ox-LDL+ROZ(12 h) 1.40 ±0.18* 1.89 ±0.18*ox-LDL+ROZ(24 h) 0.56 ±0.12* 0.85 ±0.18*

討 論

細胞因子在動脈粥樣硬化的形成中起著重要的調節作用。動脈粥樣硬化患者血清中TNF-α 的濃度比健康對照者明顯增高［5］。血清IL-6 水平可以預測急性冠脈綜合征病人30 天內甚至1 年內發生心血管事件的風險［6］。因此，TNF-α 與IL-6 是預測急性冠狀動脈綜合征的早期基礎病變及嚴重并發癥的指標。Sumiyoshi 等［7］的研究表明，冠狀動脈粥樣斑塊內的IL-10 主要由巨噬細胞表達，隨著斑塊的進展，IL-10 陽性細胞的數量增加，且與oxLDL 的沉積呈正相關。在不穩定型心絞痛病人中，外源性加入IL-10明顯抑制外周血單核細胞TNF-α 的釋放，雖然IL-10的濃度在急性冠脈綜合征患者中既可不變亦可下降，但其與促炎因子的比值總是下降的［8］。以上研究提示，促炎與抑炎間的失衡可能導致了急性冠脈綜合征的發生。而IL-10 作為一個有效的抗炎細胞因子，在調節促炎/抗炎平衡、抑制AS 形成中可能起著重要作用。

PPARγ 激動劑對炎癥反應的抑制作用已被大量研究證實。研究表明，PPARγ 配體吡格列酮減少了糖尿病大鼠循環中TNF-α 及IL-6 的生成［9］。本研究結果表明，小鼠RAW 264.7 細胞源性泡沫細胞在ox-LDL 刺激下分泌TNF-α、IL-6 及IL-10 明顯增多，而羅格列酮抑制了ox-LDL 誘導的泡沫細胞TNF-α、IL-6 及IL-10 的分泌。這提示ox-LDL 誘導的泡沫細胞啟動了促炎反應的同時，可能有抗炎反應負反饋機制的激活，導致抗炎細胞因子IL-10 的生成增多。而加入羅格列酮后因為有效抑制了泡沫細胞的促炎反應，其負反饋機制也相應減弱，導致IL-10 的生成減少。本研究同時觀察到，小鼠ox-LDL 誘導的RAW 264.7 細胞源性泡沫細胞TNF-α/IL-10 及IL-6/IL-10比值也明顯增高，而羅格列酮明顯降低這2 個比值，提示羅格列酮可能通過負反饋機制調節了促炎/抗炎反應的平衡。

負向調控細胞因子信號的SOCS 蛋白家族與促炎/抗炎反應的平衡以及AS 的形成有著密切關系。Rastmanesh 等［10］的研究表明，終末期腎功能不全患者血中TNF-α、IL-6 及CRP 含量明顯增高，同時伴隨有單核細胞及淋巴細胞SOCS1 的表達增多。SOCS3能夠抑制NF-κB 及MAPK 介導的TNF-α 信號轉導途徑及JAK-STAT 介導的IL-6 信號轉導途徑［11］。T淋巴細胞SOCS3 缺失促進了IL-10 及IL-17 的生成，促使巨噬細胞表現出抗炎癥反應的表型，并以IL-17依賴的方式抑制了粥樣斑塊及血管炎癥的進行［12］。Yu 等［13］研究大鼠胰腺炎模型發現，PPARγ 配體曲格列酮通過誘導SOCS3 表達，抑制JAK2/STAT3 信號轉導途徑，并進一步抑制IL-6 的表達。

羅格列酮調節以上促炎/抗炎反應平衡的機制與SOCS 蛋白的表達是否有關，尚不完全清楚。Park等［14］研究表明，PPARγ 激動劑通過非PPARγ 依賴的途徑誘導了大鼠神經膠質細胞SOCS1 和SOCS3的表達，從而抑制了JAK-STAT 炎癥信號途徑。而與之相反，Lebrun 等［15］的研究表明，PPARγ 配體吡格列酮通過抑制肝臟SOCS3 的表達，抑制了肝臟的炎癥反應及胰島素抵抗。本研究發現，小鼠RAW 264.7 細胞源性泡沫細胞只有很少SOCS1 和SOCS3 表達，而羅格列酮明顯上調RAW 264.7 細胞源性泡沫細胞SOCS1 和SOCS3 的表達。此結果與Park 等［14］的研究相似，提示羅格列酮可能通過PPARγ 依賴的途徑同時上調SOCS1 及SOCS3 的表達，調節促炎/抗炎反應的平衡。

總之，本研究結果表明，羅格列酮上調泡沫細胞SOCS1 和SOCS3 表達的同時，抑制了泡沫細胞分泌TNF-α、IL-6 及IL-10，調節了泡沫細胞促炎/抗炎反應的平衡，但尚未揭示出羅格列酮是否直接通過上調SOCS1 和SOCS3 的表達調節了促炎/抗炎反應的平衡，需要通過基因敲除或RNA 干擾技術進一步去驗證。

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