饑餓誘導增生性瘢痕成纖維細胞自噬發生*

呂 雷， 林 康， 高偉陽， 何智靈， 高自勉， 李浙峰， 李俊杰

增生性瘢痕(hypertrophic scar，HS)是病理性瘢痕的一種，是以成纖維細胞增殖失控、膠原過度沉積為主要特征的結締組織疾病，其發病機制至今仍不清楚。自噬是廣泛存在于真核細胞中的生命現象，在多種退變性疾病的病理過程中亦起著極為重要的作用。目前研究表明自噬與心肌［1］、腎臟［2］等器官纖維化密切相關，其在增生性瘢痕的形成過程中是否起作用，目前尚不清楚。本研究應用饑餓誘導方法來觀察增生性瘢痕中成纖維細胞自噬現象及自噬水平，以探討自噬在增生性瘢痕中的作用和意義。

材料和方法

1 材料

DMEM培養基(Gibco)，胎牛血清(四季青)，EBSS(Gibco)，單丹磺酰戊二胺(monodansylcadaverine，MDC)熒光染料(Gibco)，RIPA細胞裂解液、SDSPAGE凝膠配制試劑盒(上海碧云天公司)，BCA蛋白濃度測定試劑盒及ECL發光液(Thermo)，微管相關蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)、自噬相關蛋白Beclin-1及GAPDH兔抗人多克隆抗體(CST);羊抗兔辣根過氧化物酶IgG(北京康為世紀公司)，Trizol(Invitrogen)，RT-PCR試劑盒(Thermo)，SYBR Green I Master(Roche)。

2 成纖維細胞培養

增生性瘢痕標本來源于手術切除的增生性瘢痕組織，色澤紅，質硬，高出皮膚表面，瘢痕形成不超過1年，取材部位無感染和潰瘍，且未經任何治療，不伴有腫瘤或其它結締組織疾病。采用組織塊培養法進行原代培養，在無菌條件下切除瘢痕表皮及皮下組織，在少量胎牛血清中將標本切成1 mm×1 mm×1 mm左右的組織塊置于25 cm2培養瓶中，2 h后翻轉培養瓶，加入含10%胎牛血清的DMEM培養基。當原代細胞生長成單層，用0.25% 胰蛋白酶消化，按1∶2的比例傳代培養，實驗用第3～6代細胞。

3 實驗分組

選擇生長狀態良好3～6代的成纖維細胞，接種于6孔細胞培養板，含10%胎牛血清的DMEM培養基培養24 h。細胞分為4組，用EBSS平衡鹽溶液饑餓細胞 1 h、2 h、3 h，對照組用 10% 胎牛血清的DMEM培養液。處理組和對照組均重復3次以上。

4 Western blotting檢測LC3和Beclin-1蛋白表達

在6孔板中將各組細胞用預冷PBS洗2遍后，加入適量的細胞裂解液(radio immunoprepciption assay buffer，RIPA)和蛋白酶抑制劑(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)，超聲裂解提取蛋白。BCA法測定蛋白濃度，12%SDS-PAGE電泳，將LC3目的蛋白轉至0.22 μm PVDF膜上，Beclin-1和內參照轉至0.45 μm 的膜上，5% 脫脂牛奶常溫下封閉，孵LC3抗體(1∶1 000)、Beclin-1 抗體(1∶1 000)及GAPDH抗體(1∶1 000)4℃過夜，孵育辣根過氧化物酶標記的Ⅱ抗(1∶3 000)，ECL發光液顯色。

5 實時熒光定量RT-PCR檢測LC3和Beclin-1 mRNA表達

以Trizol法提取上述方法刺激后獲取的細胞總RNA，并用紫外分光光度計檢測RNA濃度及純度(A260/A280＞1.8)。根據濃度取1 μg總 RNA 按照逆轉錄試劑盒操作說明將RNA逆轉錄為cDNA，進行PCR擴增。LC3上游引物5’-CAACATGAGCGAGTTGGTCAAGA-3’，下游引物 5’-ACTCACCATGCTGTGCTGGTTC-3’;Beclin-1 上游引物 5’-ATGCAGGTGAGCTTCGTGTG-3’，下 游 引 物 5’-CTGGGCTGTGCTAAGTAATGGA-3’;GAPDH 上游引物 5’-AACGGATTTGGTCGTATTGGG-3’，下游引物 5’-TCGCTCCTGGAAGATGGTGAT-3’。以上引物由上海基康生物技術有限公司合成。在無菌去酶的Eppendorf管中按照說明書將配置好的real-time PCR反應液(反應總體積為20 μL)離心數秒，混勻后迅速置入Roche LightCycler?480實時熒光定量PCR儀中，兩步法qRT-PCR擴增程序:預變性95℃ 5 min，95℃10 s，60 ℃ 10 s，72 ℃ 10 s，45 個循環，獲得各樣本待測基因的 Ct值。采用2-ΔΔCt法進行試驗數據處理，其結果代表各目的基因表達的相對定量，以對照組作為矯正樣本。

6 MDC熒光染色

按Biederbick等［3］實驗方法，將細胞處理完后，去培養基，PBS洗2次，用0.05 mmol/L MDC于37℃溫育50 min后，吸去染料，PBS洗2次，4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗2次，晾干后立刻用熒光顯微鏡在400倍視野下觀察，激發濾片為365 nm，阻斷濾片為430 nm。

7 透射電鏡掃描

各組取1瓶細胞，處理后并離心成團，在EP管中加入2%戊二醛4℃固定過夜，PBS漂洗，1%鋨酸固定，1%醋酸鈾塊染，梯度丙酮脫水，包埋液包埋、固化，半薄切片及甲苯胺藍染色進行定位，LKB-V超薄切片機超薄切片，透射電鏡下觀察成纖維細胞。

8 統計學處理

數據以均數±標準差(mean±SD)表示，統計學采用組間單因素方差分析及LSD法進行兩兩比較，統計軟件采用 SPSS 13.0軟件處理，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 Western blotting檢測 LC3和Beclin-1的蛋白表達

饑餓處理 1 h后 LC3-II/LC3-Ⅰ和 Beclin-1/GAPDH增高，2 h達到高峰，3 h逐漸下降，與對照組相比差異有統計學意義(P＜0.05);Beclin-1在饑餓處理1 h后表達增高，2 h達到高峰后逐漸下降，與對照組相比差異有統計學意義(P＜0.05)，見圖1。

2 熒光定量RT-PCR檢測LC3和Beclin-1的mRNA表達

LC3 mRNA表達在饑餓處理1 h后即有增高，2 h達到高峰，3 h下降，與對照組相比差異有統計學意義(P＜0.05);Beclin-1 mRNA在饑餓處理1 h后表達增高，2 h達到高峰，3 h逐漸下降，與對照組相比差異有統計學意義(P＜0.05)，見圖2。

Figure 1.Western blotting analysis of protein expression of LC3 and beclin 1.Mean ± SD.n=3.*P ＜0.05 vs control.圖1 各組細胞LC3和Beclin-1蛋白的表達

Figure 2.LC3 and Beclin-1 mRNA expression assessed by realtime fluorescence quantitative RT-PCR.Mean±SD.n=3.*P ＜ 0.05 vs control.圖2 各組細胞LC3和Beclin-1 mRNA的表達

3 MDC熒光染色觀察

MDC熒光染料作為自噬泡的示蹤劑，在熒光顯微鏡下呈藍綠色點狀結構，多分布于核周。對照組細胞中可見少量的點狀結構;饑餓處理2 h后，MDC陽性細胞數明顯增加，藍綠色點狀密度也明顯升高，見圖3。

Figure 3.MDC staining of the autophagic vacuoles in hypertrophic scar fibroblasts(×400).A:control;B:2 h after starvation.圖3 增生性瘢痕成纖維細胞MDC熒光染色

4 透射電鏡觀察

透射電鏡下可見，對照組細胞核較大，核仁明顯，胞漿內清晰可見線粒體、內質網。饑餓處理2 h后細胞胞漿內可見大量囊泡狀結構，在高倍鏡下可見雙層膜結構，包含著未消化的胞漿成分或細胞器，見圖4。

Figure 4.Electron micrographs of hypertrophic scar fibroblasts.A:control;B:2 h after starvation.圖4 電鏡觀察增生性瘢痕成纖維細胞

討 論

自噬廣泛存在于真核細胞中，是一個細胞內物質通過溶酶體被降解的過程，生命體借此保持正常的生長發育、細胞分化及代謝平衡，以維持細胞內環境的穩定［4］。當自噬功能被抑制或干擾時，細胞的降解功能會出現障礙，并導致多種疾病的發生，如腫瘤、神經退行性疾病等［5-7］。近年來研究發現自噬在心肌、腎臟等器官纖維化發生發展過程中發揮重要的作用。Tannous等［1］發現自噬不足促進心肌間質纖維化。Kim等［2］研究表明自噬與腎纖維化有關，誘導自噬能明顯降低膠原I的蛋白表達。在皮膚中也發現增生性瘢痕組織自噬表達水平較正常皮膚組織明顯降低，提示增生性瘢痕的發生可能與自噬不足有關［8］。然而，能否在體外細胞水平誘導增生性瘢痕成纖維細胞發生自噬，成為進一步研究自噬與增生性瘢痕形成關系的關鍵。

饑餓法是目前誘導細胞自噬的一種經典方法，在哺乳動物細胞的自噬研究中應用廣泛［9-10］。本實驗設計采用EBSS代替培養液，為增生性瘢痕成纖維營造饑餓環境，然后檢測自噬相關指標，研究營養缺乏對增生性瘢痕成纖維細胞自噬的影響。

LC3是酵母菌自噬相關蛋白Atg8在哺乳動物中的同源體，調控微管蛋白的組裝和去組裝，參與自噬體的形成。LC3具有2種形式:LC3-Ⅰ和 LC3-Ⅱ。LC3-Ⅱ定位于前自噬泡和自噬泡膜表面，常作為自噬的特異性標志物。Beclin-1是酵母Atg6/Vps30在哺乳動物中的同源體，表達于反面高爾基網狀結構，與Ⅲ型PI3K和Atg14L結合形成復合體，調控自噬前體產生和自噬體形成［11］。我們應用Western blotting及熒光定量RT-PCR檢測LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白和mRNA的表達，隨饑餓時間延長而升高，2 h達到高峰，較對照組明顯升高，表明饑餓可誘導成纖維細胞自噬的發生。通過MDC熒光染色觀察，饑餓處理2 h，MDC陽性細胞數較對照組明顯增加;電鏡是證明自噬現象的金標準，我們在電鏡下觀察到饑餓處理2 h細胞內存在自噬體，進一步證實饑餓可誘導成纖維細胞自噬的發生。

增生性瘢痕發病機制復雜，自噬在其中的作用及機制尚不清楚，可能與細胞凋亡［12］、膠原降解［13］等有關。本實驗在體外成功應用饑餓誘導出增生性瘢痕成纖維細胞的自噬，為進一步在細胞及分子水平研究自噬與增生性瘢痕形成的關系提供一定的基礎，從而為將來防治增生性瘢痕提供理論依據和新的治療靶點。

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