尼古丁對人牙周膜成纖維細胞超微結構及分泌細胞因子的影響*

陳慧中， 卜欠欠， 孔衛東， 曾慧蘭， 李 陽， 劉宏偉

牙周膜成纖維細胞(periodontal ligament fibroblasts，PDLFs)是牙周膜中數量最多、功能最重要的細胞之一，參與膠原蛋白的合成與吸收，與基質形成、骨質形成有關。吸煙是牙周病尤其是重度牙周病的高危因素，尼古丁占煙草生物堿總量約95%以上，近年來尼古丁對牙周組織再生和修復的毒性研究引起關注［1］，而其作用機制尚未十分明確，許多學者從尼古丁對PDLFs的堿性磷酸酶變化、蛋白質合成、尼古丁型乙酰膽堿受體及細胞外基質影響等方面進行研究，證實尼古丁從多方面影響牙周病的發生、發展和預后［2-4］。本研究擬探討尼古丁對PDLFs的細胞形態、增殖、細胞周期、凋亡及細胞因子生成的影響，以進一步闡明尼古丁致病機制。

材料和方法

1 材料

1.1 主要試劑與儀器 人牙周膜成纖維細胞株(上海拜力生物科技有限公司);尼古丁(北京伊普瑞斯公司);DMEM/F12培養基和澳洲胎牛血清(fetal bovine serum，FBS;Gibco);青霉素和鏈霉素(華北制藥公司);MTT、胰酶、碘化丙啶(propidium iodide，PI;Sigma);PI-Annexin V雙染試劑盒(北京寶賽生物技術公司);CO2培養箱(Thermo Forma);原子力顯微鏡(Thermo);酶標儀(BioTek);流式細胞檢測儀(BD);透射電鏡(Philips);轉化生長因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)、細胞間黏附分子 1(intercellular adhesion molecule 1，ICAM-1)、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和血管細胞黏附分子1(vascular cell adhesion molecule 1，VCAM-1)酶聯免疫試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司);堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)和胰島素樣生長因子 I(insulin-like growth factor I，IGF-I)酶聯免疫試劑盒(華美生物工程有限公司)。

1.2 細胞培養 PDLFs按(1.0～1.5)×106/L的密度接種于T-25培養瓶，含15%FBS的DMEM/F12進行培養。細胞達80%融合時，0.25%胰蛋白酶消化細胞，1∶2或1∶3比例傳代，每3～4 d換液。取3～7代細胞實驗。實驗組加15%FBS的DMEM/F12培養液配制的不同濃度尼古丁，對照組加含15%FBS的DMEM/F12培養液。

2 方法

2.1 細胞形貌及超微結構觀察 (1)細胞爬片后，實驗組加0.6 g/L尼古丁孵育24 h，取出蓋玻片，2.5%戊二醛固定10 min，漂洗，風干，原子力顯微鏡觀察;(2)PDLFs以6×108/L接種培養，細胞達80%融合，實驗組加0.8 g/L 尼古丁，孵育 24 h，2.5%戊二醛固定4 h，1%鋨酸固定1～2 h，脫水、包埋、切片，3%醋酸鈾－枸櫞酸鉛雙染色，透射電鏡觀察。

2.2 MTT法測細胞增殖抑制率 細胞以3×107/L接種于96孔板，每孔100 μL，培養24 h。實驗組加尼古丁(0.5、0.8、1.0、1.5 g/L)作用 24、48、72 h，每孔加20 μL MTT，孵育4 h，每孔加=甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)150 μL，酶 標 儀 測 吸 光 度(A490)。計算細胞增殖抑制率進行細胞活性評價，細胞生長增殖抑制率(%)=(1－實驗組 A490/正常對照組A490)×100%。

2.3 PI法測細胞周期 細胞以2×108/L接種于6孔板培養 24 h，實驗組加尼古丁(0.2、0.4、0.6 g/L)孵育24 h，冰乙醇固定，PI染色，流式細胞儀檢測，BD FAC Sort Cell Quest軟件分析結果。

2.4 Annexin V-FITC/PI雙染測細胞凋亡率 實驗組加尼古丁(0.5、1.0、1.5 g/L)孵育 24 h，洗滌，離心，加 200 μL 結合緩沖液，分別加 2 μL Annexin VFITC 和2 μL PI，流式細胞儀檢測。

2.5 ELISA法檢測培養上清細胞因子水平 細胞以2×108/L接種于6孔板培養24 h，實驗組加尼古丁(0.4、0.6、1.0 g/L)，24 h 收上清液 －80 ℃冷藏，按ELISA試劑盒步驟操作，酶標儀測吸光度(A450)，CurveExpert 1.3軟件計算細胞因子ICAM-1、VCAM-1、VEGF、TGF-β1、IGF-I和 bFGF 濃度。

3 統計學處理

采用SPSS 13.0軟件，計量資料以均數±標準差(mena±SD)表示，組間均數比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 尼古丁對PDLFs表面形貌和超微結構的影響

原子力顯微鏡下見正常細胞呈長梭形，胞質與胞核邊界清晰，細胞骨架明顯，表面較粗糙，向四周延伸出數量不等的偽足樣突起，見圖1A。尼古丁作用后，細胞縮小，胞質中見大量空泡，核膜破壞，胞質與胞核邊界模糊，見圖1B。透射電鏡下，正常PDLFs呈圓形或類圓形，細胞膜完整，表面有較多微絨毛和突起，細胞核有單核或多核，形狀不規則，核膜清晰，1個或多個核仁，核質比例大，胞漿含散在粗面內質網和核糖體，線粒體嵴清晰連續，見圖2A、B、E、G。尼古丁作用后，細胞表面突起和微絨毛增多，胞內大量空泡，水腫明顯。胞核固縮崩解，染色質濃縮邊集，見圖2C、D。粗面內質網擴張成池，內充以低電子密度物質，見圖2F。線粒體嵴擴張，見圖2H，基質電子密度增高，部分水腫，余細胞器未見明顯變化。

Figure 1.Effect of nicotine on surface morphology of PDLFs observed by atomic force microscopy.A1～A3:control group;B1～B3:nicotine(1.0 g/L)group.1:the overall surface morphology;2，3:the enlarged areas.圖1 尼古丁對PDLFs表面形貌的影響

Figure 2.Ultrastructure of PDLFs observed by transmission electron microscopy.A，B:overall morphology in control group.C，D:overall morphology in nicotine group;E:mitochondria in control group;F:mitochondria in nicotine group;G:endoplasmic reticulumin in control group;H:endoplasmic reticulum in nicotine group.A，C:×3 700;B，D:×8 900;E，F:×17 500;G，H:×24 000.圖2TEM觀察PDLFs超微結構

2 尼古丁對PDLFs增殖抑制率的影響

不同濃度尼古丁(0.5、0.8、1.0、1.5 g/L)作用24、48、72 h，均抑制細胞增殖，呈時間和濃度依賴性(P ＜0.05)，見表1、2。

3 尼古丁對PDLFs細胞周期的影響

0.2 、0.4、0.6 g/L 尼古丁作用24 h 后，隨濃度增高，各組細胞G0/G1期比例逐漸增高(P＜0.05)，S期和G2期比例則呈下降趨勢，見圖3、表3。

表1 不同濃度尼古丁對PDLFs增殖的影響Table 1.Effects of different concentrations of nicotine on proliferation of PDLFs(A490.Mean ± SD.n=3)

表2 不同濃度尼古丁作用PDLFs的抑制率Table 2.Inhibitory rate of PDLFs after treatment with nicotine at different concentrations(mean±SD.n=3)

4 尼古丁對PDLFs凋亡率的影響

0.5 、1.0、1.5 g/L尼古丁作用細胞24 h后，細胞凋亡率均高于對照組。對照組早期凋亡比率為(0.700±0.566)%;0.5 g/L組、1.0 g/L組與1.5 g/L組早期凋亡比率分別為(0.750±0.495)%、(0.750±0.495)%和(1.600±0.990)%，雖然高于對照組，但差異無統計學意義(P＞0.05)，見圖4。

5 尼古丁對細胞因子分泌水平的影響

不同濃度尼古丁細胞作用后，bFGF水平下降，0.6 g/L尼古丁組與對照組相比有統計學意義(P＜0.05);IGF－I水平下降，呈濃度依賴性(P ＜0.05);ICAM-1水平上升(P ＜0.05)，見表4。VCAM-1水平上升，但差異無統計學意義(P ＞0.05);TGF-β1水平上升，1.0 g/L尼古丁組與對照組相比有統計學意義(P＜0.05)，VEGF水平上升，但差異無統計學意義(P ＞0.05)，見表 5。

討 論

牙周膜是位于牙骨質和牙槽骨之間的纖維連接組織。PDLFs具多種生物學功能，不僅合成膠原、基質、彈力纖維和糖蛋白，還可分化為成牙骨質細胞、成骨細胞，形成牙骨質、牙槽骨等，尚有吸收膠原吞噬異物的能力，對平衡牙周膜結構和功能，維持、再生和損傷修復牙齒支持組織起重要作用。PDLFs的數量、形態、增殖是其生物學活性如黏附、生物合成和分化等的必要保證。煙草中含4 000多種毒素，如尼古丁、CO、亞硝基胺等，其中主要成分尼古丁對PDLFs的氧化損傷引起關注。吸煙后牙周局部尼古丁濃度增高［5］，使細胞內活性氧自由基陡增，消耗GSH 等抗氧化物質［6］，致細胞凋亡［7］。吸煙者牙周炎區段數高于非吸煙者，且煙量可影響牙周病，即重度吸煙者的牙周炎區段數高于輕、中度吸煙者［8-9］。本研究顯示尼古丁抑制細胞增殖，促進其凋亡主要以影響PDLFs膜性結構(線粒體和內質網)破壞為主，導致細胞蛋白合成和有氧呼吸功能受損，影響細胞活性與功能，造成不可逆損傷，從而減弱PDLFs黏附遷移能力，導致牙周病。而細胞內骨架改變可反映外部的刺激作用［9］，至于尼古丁對細胞周期和凋亡率的影響，雖然DNA合成阻滯于G0/G1期，并呈劑量依賴性，但與對照組相比，差異無統計學意義(P＞0.05)，所以，影響凋亡主要以致膜性結構破壞為主。

Figure 3.Cell cycle distribution of PDLFs treated with nicotine for 24 h.A:control group;B:nicotine(0.2 g/L)group;C:nicotine(0.4 g/L)group;D:nicotine(0.6 g/L)group.圖3 尼古丁作用PDLFs 24 h后細胞周期的變化

表3 不同濃度的尼古丁干預PDLFs 24 h后細胞周期的變化Table 3.Cell cycle distribution of PDLFs treated with nicotine at various concentrations for 24 h(%.Mean±SD.n=3)

Figure 4.Apoptotic rate of PDLFs treated with nicotine at various concentrations for 24 h.A:control group;B:nicotine(0.5 g/L)group;C:nicotine(1 g/L)group;D:nicotine(1.5 g/L)group.圖4 不同濃度尼古丁作用PDLFs 24 h后的凋亡率

表4 尼古丁對PDLFs分泌bFGF、IGF-I和ICAM-1的影響Table 4.Effects of nicotine on secretion of bFGF，IGF-I and ICAM-1 in PDLFs(mean±SD.n=3)

表5 不同濃度尼古丁對PDLFs分泌VCAM-1、TGF-β1和VEGF的影響Table 5.Effects of nicotine on secretion of VCAM-1，TGF-β1and VEGF in PDLFs(ng/L.Mean±SD.n=3)

尼古丁尚可在細胞水平干擾損害免疫細胞功能，影響牙周病進程。bFGF可促進牙周細胞增殖，促進牙周創傷愈合早期血管網的形成［10］。其分泌水平下降，牙周組織修復受到抑制。杜克難等［11］報道bFGF可誘導胚胎早期中胚層的生長，有促進口腔唇部軟組織創傷愈合的作用。IGF-I有多種生物學活性，包括促進細胞生長、分化及創口愈合等，有強烈的促進PDLFs分裂、增殖作用［12］，其機制可能通過牙周膜表面的IGF型受體發揮作用［13］。本實驗表明，尼古丁使PDLFs分泌bFGF和IGF-I水平均下降，抑制了PDLFs分裂和增殖。

ICAM-1是免疫球蛋白超家族成員，調節炎癥信號轉導，在與白細胞結合和向炎癥區域轉移中具重要作用［14］。周衛輝等［15］報道尼古丁可增加內皮細胞ICAM-1表達，促進中性粒細胞與內皮細胞黏附，在慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)慢性炎癥發病中起重要作用。VCAM-1激活血管內皮細胞表達血管黏附分子，與單核細胞和淋巴細胞結合，從血管內壁移行至炎癥部位，促發炎癥。本實驗結果顯示尼古丁使PDLFs分泌ICAM-1和VCAM-1水平上升，提示尼古丁可能促進牙周炎癥發生。

TGF-β1能調節牙周組織的免疫應答，促進牙周膜細胞增殖，增加成纖維細胞合成膠原及纖維黏連素，減少基質金屬蛋白酶和纖溶酶激活劑的合成和結締組織的破壞，使牙周軟、硬組織修復再生［16］。炎癥刺激可使VEGF分泌增加，促進局部血流和自身分泌，促血管增殖。但吸煙者的牙周處于缺氧狀態，VEGF的高表達雖可促進血管生成，但正調節的VEGF mRNA及其蛋白又可募集破骨細胞，加速牙槽骨吸收［17］。本實驗顯示TGF-β1和VEGF濃度上升，有利于牙周組織修復。VEGF變化的意義尚需進一步研究。

綜上所述，尼古丁改變PDLFs細胞形態及超微結構，抑制細胞增殖，促進凋亡，影響其黏附功能;使PDLFs分泌bFGF和IGF-I水平下降，抑制PDLFs增殖;使ICAM-1和VCAM-1分泌增加，破壞牙周組織;而TGF-β1和VEGF等在炎癥刺激后分泌增加則有助于修復牙周組織。研究顯示VEGF存在雙重作用，在不同環境中表達水平有差異，其表達變化的意義尚待探討。

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