嗜酸氧化亞鐵硫桿菌中金屬轉運基因的克隆與差異表達

吳學玲，張云靜，劉代剛，段 紅，范宏偉，劉學端

(中南大學 資源加工與生物工程學院 教育部生物冶金重點實驗室，長沙 410083)

At.ferrooxidans是一種以亞鐵、硫粉或者金屬硫化物作為能源物質的革蘭氏陰性、化能自養和嗜酸的中溫浸礦菌[1]，工業上廣泛應用于銅、鋅、鎳、鎘和其他金屬離子的生物浸出[2]。在生物浸出過程中，At.ferrooxidans經常遇到許多不利的環境變化，如生長環境溫度升高、營養物質缺乏、pH值改變和有毒重金屬的出現[3]。然而At.ferrooxidans對某些金屬離子具有較強的抗性，研究發現向培養基中加入 600 mmol/L的 Zn2+或者 200 mmol/L的 Cu2+之后，At.ferrooxidans仍然能夠生長[4]，這使At.ferrooxidans在回收銅或者鋅等金屬的生物浸出過程中具有廣泛應用價值[5]。因此，研究這些微生物耐受高濃度金屬離子的分子機制意義重大。At.ferrooxidans DC菌株從中國廣西大廠礦區的酸性礦坑水中分離出來，利用電感耦合等離子體原子發射光譜測定來自大廠礦區的礦坑水樣品的元素組成，結果表明樣品中含有多種元素，例如錳、鋅、鎘、銅、鐵和硫等，其中錳、鋅和鎘含量分別是 815.9、1655.71 和 56.13 mg/L[6?7]。

雖然鋅和錳對于生物體來說是必需的微量元素，許多重要的功能蛋白和酶都需要鋅作為其結構或者輔助因子[8?9]。但是，一旦體內鋅離子的濃度過高，將會對呼吸鏈產生抑制從而對細胞造成毒害作用[10?11]。錳以幾種不同的價態存在，作為蛋白輔因子時它在電子傳遞反應中起催化劑的作用。同時，錳是必需的金屬酶的組分，包括依賴于Mn2+的超氧物歧化酶。另外，錳是許多酶的激活劑，這些酶主要參與不同的代謝途徑如 DNA合成、糖代謝或者蛋白修飾等。與其他必需的過渡態金屬一樣，過量的錳對生物體也會產生毒害作用。因為錳和鐵競爭共同的轉運體和配體，錳毒性的經典效應是引起缺鐵[12]。鎘對于生物體來說是一種非必需的重金屬元素，少量存在就對生物體造成很大的毒害作用。大廠礦區的浸礦液中金屬離子的含量遠遠超出At.ferrooxidans生長需要的微量元素，但是At.Ferrooxidans依然能很好地生長，說明它能夠耐受很高濃度的金屬離子。然而，至于是何種機制使 At.ferrooxidans具有如此高的抗錳、鋅和鎘的能力至今仍不清楚。關于At.ferrooxidans對金屬的抗性研究集中在Cu2+、As3+及Ag+的抗性機制，而關于其對Mn2+、Zn2+和 Cd2+的抗性機制較少被報道。本文作者旨在通過研究金屬轉運基因在金屬離子脅迫下的相對表達，說明金屬離子轉運基因編碼的蛋白參與金屬離子的轉運，從金屬離子轉運方面研究At.ferrooxidans耐受高濃度金屬離子的分子機制。已發現的保護細胞免受高濃度Zn2+的毒害的外排系統有3類：耐藥結節分化家族RND (Resistance, nodulation and division)，多藥物外排轉運體、P型ATP酶和陽離子擴散推動子[13]。幾個轉運體基因家族參與 Mn2+的轉運，包括陽離子/H+反向轉運體，與抗性相關的巨噬細胞蛋白轉運體，陽離子促進擴散轉運體家族和P型ATP酶[14]。CadA P型ATP酶和RND CzcCBA 復合物參與Cd2+的外排[15]。

本文作者以 4個金屬轉運基因(afe_0671、afe_0674、afe_1143和afe_1144)作為目標基因，利用實時熒光定量 PCR 技術[16?17]驗證它們在不同濃度Zn2+、Mn2+和Cd2+的脅迫下的相對表達，并采用生物信息學手段對這4個基因及其編碼的蛋白進行結構和功能的預測，為研究At.ferrooxidans對金屬離子的抗性機制奠定理論基礎。

1 實驗

1.1 實驗材料

1.1.1 菌種與培養基

At.ferrooxidans DC菌株由中南大學生物冶金教育部重點實驗室從取自廣西大廠銅礦的酸性礦坑廢水中分離得到。

At.ferrooxidans DC菌株生長于 9K基礎培養基[18]，30 ℃，170 r/min 搖床無菌培養。能源物質為單質硫 10 g/L。

1.1.2 其他試劑

DNA提取試劑盒為TIANamp Bacteria DNA Kit(TIANGEN Inc.)，DNA凝膠回收試劑盒為TIAgel midi purification Kit (TIANGEN)，PGM-T平末端連接試劑盒(TIANGEN Inc.)，RNA 提 取試 劑 為 Trizol(Invitrogen)，RNA純化試劑盒為 Rneasy mini kit(Qiagen)，RNA反轉錄試劑盒為Rever Tra Ace?qPCR RT Kit (TOYOBO)。

1.2 實驗方法

1.2.1 DNA的提取及4個基因的克隆測序

細菌基因組提取使用 TIANamp Bacteria DNA Kit，以提取后的基因組為模板擴增目標基因。PCR擴增條件為：預變性94 ℃，3 min；變性94 ℃，40 s；退火60 ℃，45 s；延伸72 ℃，90 s，共32個循環；最后72 ℃延伸10 min。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測后切膠純化目的片段，將純化后的PCR產物平末端加A之后連接到PGM-T載體轉化到Escherichia coli DH5α感受態細胞中，重組菌在LB平板上過夜培養之后挑取陽性克隆子做穿刺管培養12 h后送去上海生物工程公司測序。實驗中所用到的引物均在表1中。

1.2.2 At.ferrooxidans DC菌株對Mn2+、Zn2+及Cd2+最大耐受濃度的測定

根據預實驗的結果，本研究中選用 0.32、0.34、0.36和0.38 mol/L的Mn2+，0.06、0.1、0.14和0.18 mol/L的Zn2+及0.04、0.06和0.08 mol/L的Cd2+作為脅迫環境。將At.ferrooxidans DC菌株接種至加入不同濃度的Mn2+、Zn2+和Cd2+的9K培養基中，起始菌濃度均為5×106cell/mL，30 ℃，170 r/min 搖床無菌培養。其中空白(Blank)是不接種不加入金屬離子的生長條件，0 mol/L是接種但不加入金屬離子的生長條件。每24 h測定培養液的pH值，測定10 d。

1.2.3 At.ferrooxidans DC菌株的生長條件

根據最大耐受濃度的測定，本研究中選用 0.1、0.2、0.3和0.4 mol/L 的 Mn2+，0.04、0.08、0.12和0.16 mol/L的Zn2+以及0.04和0.08 mol/L的Cd2+作為刺激環境。首先將At.ferrooxidans DC菌株接種至9 K培養基，培養至對數期時離心收集菌種(4 ℃，10 min，12 000 r/min)，然后將所收集的菌接種于含有0、0.1、0.2、0.3 和 0.4 mol/L Mn2+和 0、0.04、0.08、0.12和0.16 mol/L Zn2+及0.04、0.08 mol/L Cd2+的9 K 培養基中，使菌的起始濃度均為5×107cell/mL，短暫培養之后，離心收集菌種，馬上進行RNA提取。

1.2.4 RNA的提取與cDNA的合成

采用Trizol一步法提取總RNA，用RNeasy mini kit (Qiagen)純化總RNA，用NanoDrop微量分光光度計(NanoDrop Technologies)檢測RNA的濃度和純度。取等量的 RNA進行反轉錄，反轉錄采用 Rever Tra Ace?qPCR RT Kit (TOYOBO)，以總RNA中mRNA為模板反轉錄合成cDNA，反轉錄后用 NanoDrop微量分光光度計測定每一個cDNA的濃度，然后將cDNA樣品濃度均稀釋至200 mg/L，于?20 ℃保藏備用。

1.3 RT-qPCR

1.3.1 標準樣品的制備

分別以目標基因及內參基因為樣品, 以cDNA為模板進行普通PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳，切下目的條帶采用凝膠回收試劑盒進行純化。然后將純化后的PCR產物進行10倍梯度稀釋, 取103～109做標準品用于制備標準曲線, 做7個點。普通PCR程序如下：預變性94 ℃，3 min；變性94 ℃，30 s；退火55 ℃，30 s；延伸72 ℃，30 s，共30個循環；最后72 ℃延伸5 min。

1.3.2 實時熒光定量PCR

RT-qPCR的反應程序如下：預變性95 ℃，3 min；變性 95 ℃，30 s；退火 58 ℃，30 s；延伸 72 ℃，30 s，共40個循環；退火55～95 ℃，10 s, 每循環一次溫度增加0.5 ℃共80個循環。每組實驗設置3個平行，選用16S rRNA為內參基因[19]，陰性對照不加任何模板。實時熒光定量 PCR的引物如表2所列，數據采用Expression Macro? Version 1.1 (http∶//www.gene-quantification.info/ )軟件進行處理。

1.3.3 生物信息學分析

用 BLAST (http∶//www.ncbi.nih.gov/blast/Blast.cgi)進行相似性搜索。ORF Finder(http∶//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)尋找基因的開放閱讀框。ExPASy Proteomics Server (http∶//expasy.org/cgi-bin/ pi_tool)進行蛋白質等電點及相對分子量的計算。PSORTb v.3.0(http∶//www.psort.org/psortb)做蛋白亞細胞結構定位。TMHMM Server v.2.0 (http∶//www.cbs.dtu.dk// servive-s/TMHMM-2.0/)做蛋白質的跨膜分析。NCBI conserved domains(http∶//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrp sb.cgi)[20]尋找蛋白的保守區域。

表1 常規PCR引物Table 1 Primers used in regular PCR

表2 用于RT-qPCR的目標基因的引物Table 2 Primers used for RT-qPCR of targeted genes

2 結果與討論

2.1 4個基因的克隆測序

以At.ferrooxidans DC基因組為模板通過擴增和克隆得到 afe_0671、afe_0674、afe_1143和 afe_1144基因片段，說明At.ferrooxidans DC菌株中含有這4個基因。各基因的測序結果經 BLAST序列比對，結果顯示與At.ferrooxidans ATCC 23270中對應的基因的序列相同，說明這4個基因編碼的蛋白的功能與At.ferrooxidans ATCC 23270菌株中對應的基因編碼的蛋白的功能可能相同。

2.2 At.ferrooxidans DC菌株對Mn2+、Zn2+及Cd2+最大耐受濃度的測定

實驗結果表明不加入金屬離子時，培養10 d后，培養液的pH值從2.0降為1.18。加入不同濃度的金屬離子之后培養液的pH值變化受到不同程度的抑制，且隨著金屬離子濃度的增加，pH值變化越小。本研究中At.ferrooxidans DC菌株是以硫粉作為能源物質，培養液pH值變化越小，說明DC菌株的生長被抑制作用越強。圖1所示為不同金屬離子濃度下pH值的變化曲線。從圖1(a)可以看出，當Mn2+的濃度為0.32 mol/L，培養10 d后，培養液的pH值從2.0降為1.41，說明DC菌株的生長明顯的被抑制；當Mn2+的濃度為0.38 mol/L，培養10 d后，培養液的pH值降為1.85，培養液的pH值變化很小，DC菌株的生長幾乎完全被抑制，所以At.ferrooxidans DC菌株對Mn2+的最大耐受濃度是0.38 mol/L。由圖1(b)可看出，當Zn2+的濃度為0.06 mol/L時，培養10 d后，培養液的pH值從2.0降為1.25，At.ferrooxidans DC菌株的生長較小的被抑制；當Zn2+的濃度為0.18 mol/L時，培養10 d后，培養液的pH值沒有變化，At.ferrooxidans DC菌株的生長完全被抑制，所以At.ferrooxidans DC菌株對Zn2+的最大耐受濃度是0.18 mol/L。由圖1(c)可看出，當Cd2+的濃度是0.04 mol/L時，培養10 d后，培養液的pH值降為1.28，DC菌株的生長較小的被抑制；當Cd2+的濃度是0.08 mol/L時，培養10 d后，培養液的pH值降為 1.93，DC菌株的生長幾乎完全被抑制，所以At.ferrooxidans DC菌株對 Cd2+的最大耐受濃度是0.08 mol/L。

圖1 不同金屬離子濃度下pH值變化曲線Fig.1 pH change curves at different metal ions concentrations∶ (a)Mn2+; (b)Zn2+; (c)Cd2+

以硫粉作為能源物質時，At.ferrooxidans DC菌株對Mn2+、Zn2+及Cd2+的最大耐受濃度分別是0.38、0.18和0.08 mol/L。實驗結果表明，Mn2+、Zn2+和Cd2+對DC菌株毒害作用由大到小順序依次為 Cd2+、Zn2+、Mn2+。3種離子對DC菌株毒害作用大小不同包含兩方面的原因，一方面是3種金屬離子本身的毒性大小不同；另一方面是DC菌株對這3種金屬離子的解毒機制不同。鋅和錳對于生物體來說是一種必需的微量元素，低濃度時有利于細菌的生長，其濃度超過正常生理濃度時就會產生毒害作用，抑制細菌的生長。而鎘對于生物體來說是一種非必需的元素，只要存在就會對細菌產生毒害作用[21]，所以 Cd2+對 At.ferrooxidans DC菌株的毒害作用最大。生物體有5種基本的機制即有毒金屬離子外排、酶的轉變、胞內胞外的隔離、通過透性屏障的外排和降低細胞內靶部位的敏感性保護細胞免受金屬離子毒害[22]。At.ferrooxidans中存在許多金屬抗性基因和金屬離子轉運體基因，這些基因編碼的蛋白可能參與金屬離子的解毒過程。

2.3 不同濃度Mn2+、Zn2+和Cd2+刺激下金屬轉運基因的相對表達

實時熒光定量PCR后，溶解曲線峰帶單一，沒有雜峰出現，說明引物的特異性較好；標準曲線R2值均接近于1，說明Ct值與其起始拷貝數的對數值之間的關系性好; 內參基因16S rRNA在不同環境中的表達量均較為衡定，無顯著性差異(P＜0.05)。經內參基因校正，在Mn2+刺激下各基因的相對表達量如圖2(a)所示，在低濃度Mn2+(0.1 mol/L)刺激下，其中的3個基因(afe_0671，afe_1143和afe_1144)的表達量分別上調1.99、3.42和2.12倍，afe_0674的表達量沒有上調；在高濃度Mn2+(0.4 mol/L)刺激下，4個基因(afe_0671，afe_0674，afe_1143和 afe_1144)的表達量分別上調437.66、743.86、301.14和676.54倍。在Zn2+刺激下各基因相對表達量如圖2(b)所示，在低濃度Zn2+(0.04 mol/L)刺激下，4個基因(afe_0671，afe_0674，afe_1143和afe_1144)的表達量分別上調1.3、1.32、4.13和5.7倍；在高濃度 Zn2+(0.16 mol/L)刺激下，4個基因(afe_0671，afe_0674，afe_1143和afe_1144)的表達量分別上調237.78、85.49、227.41和149.29倍。在Cd2+刺激下各基因的相對表達量如圖2(c)所示，在低濃度Cd2+(0.04 mol/L)刺激下，4 個基因(afe_0671、afe_0674，afe_1143和afe_1144)的表達量分別上調3、3.29、5.02和6.06倍；在高濃度Cd2+(0.08 mol/L)刺激下，4個基因(afe_0671、afe_0674、afe_1143和afe_1144)的表達量分別上調 6.08、12.32、18.55和 32.03倍。從圖2中可以看出，在不同濃度的Mn2+、Zn2+及Cd2+的刺激下，4個基因(afe_0671、afe_0674、afe_1143和afe_1144)的表達量的表達量均上調，且隨著Mn2+、Zn2+及Cd2+濃度的增加，各基因上調的倍數升高。實驗數據表明At.ferrooxidans DC菌株中這 4個基因(afe_0671、afe_0674、afe_1143 和 afe_1144)對于 Mn2+、Zn2+及Cd2+的脅迫非常敏感，且隨著金屬離子濃度的增加，其表達量上調倍數升高，說明它們可能與Mn2+、Zn2+及Cd2+的轉運密切相關。

圖2 不同金屬離子濃度刺激下金屬轉運基因的差異表達Fig.2 Differential expression of metal transport genes under different metal ions concentrations∶ (a)Mn2+; (b)Zn2+; (c)Cd2+

MOORE和HELMANN[23]認為在金屬離子有限的條件下金屬離子和螯合復合物通過主動運輸轉運至體內；相反的，當金屬離子積累到超過生理需求時，金屬螯合或者外排系統就會被誘導。另外，NAVARRO等[19]認為隨著金屬離子濃度的增加基因表達量升高，編碼外排系統的基因被誘導。在金屬離子刺激下，4個基因(afe_0671、afe_0674、afe_1143和afe_1144)的表達量上調，且隨著金屬離子濃度的增加，上調倍數增加，推測這4個基因編碼的蛋白的作用可能是外排金屬離子或者參與金屬離子的外排。雖然afe_0671和afe_1144編碼的蛋白被報道特異性的轉運Zn2+[24?25]，但是afe_0671、afe_1143和afe_1144的表達量也被報道在Cu2+的刺激下上調[2,19]，說明afe_0671、afe_1143和afe_1144所編碼的蛋白也與Cu2+的轉運相關。結合以前的報道推測，afe_0671、afe_1143和afe_1144所編碼的蛋白可能參與Zn2+、Mn2+、Cu2+和Cd2+的外排；afe_0674編碼的蛋白可能參與Zn2+、Mn2+及Cd2+的外排，至于其是否參與Cu2+的外排還沒有報道過。這些基因編碼的蛋白是否參與其他的金屬離子的轉運，還有待實驗證明。

在At.ferrooxidans ATCC 23270的全基因組中，afe_0671編碼重金屬外排系統蛋白， afe_1143編碼重金屬外排轉運體，MFP(Membrane fusion protein)subunit，afe_0671和afe_1144基因編碼屬于CzcA家族的重金屬外排泵蛋白。細菌中 CzcA是復合物CzcCBA的組分，化學滲透復合物 CzcCBA 是由CzcC(小的外膜蛋白)，CzcB(連接CzcA與CzcC形成一個連續的從細胞質到胞外通道的周質耦合蛋白)和CzcA(一個大的內膜蛋白)組成一個內外膜通道。另外，作為離子/質子交換載體外排 Cd2+、Zn2+和 Co2+的CzcCBA復合物是金屬抗性家族RND的一個成員[26]。屬于CzcA家族的外排鎘、鋅、鈷的重金屬外排泵負責金屬的解毒。克隆實驗結果顯示，At.ferrooxidans DC中的這4個基因的序列與At.ferrooxidans ATCC 23270中對應的基因的序列相同，說明這4個基因編碼的蛋白的功能與At.ferrooxidans ATCC 23270菌株中對應的基因編碼的蛋白的功能可能相同。在標準菌株中，這4個基因編碼的蛋白的功能被推測為參與金屬離子的外排，所以，在At.ferrooxidans DC中，這4個基因編碼的蛋白的功能也是參與金屬離子的外排，驗證了本文作者的推測。

為了進一步驗證本文作者的推測，采用生物信息學的手段對這4個基因(afe_0671、afe_0674、afe_1143和afe_1144)及其編碼的蛋白進行分析?；騛fe_0671的開放閱讀框架的長度為3114 bp，編碼一個相對分子量為112324.22 Da、等電點為9.18的12次跨膜的膜蛋白，該蛋白的保守序列是COG3696，被稱為假定的銀外排泵，主要參與無機離子的轉運與代謝；afe_0674基因的開放閱讀框架的長度為 363bp，編碼一個相對分子量為12701.82 Da，等電點為9.73的蛋白，它的保守區域是 cl02363，被稱為 CusF(Copper binding periplasmic protein )。在大腸桿菌中CusF是參與銅和銀抗性的周質蛋白，CusF形成一個由5條鏈組成的β桶狀的 OB(Oligonucleotide/oligosaccharide binding)折疊。Cu2+結合到CusF保守的H36、M47 and M49殘基上；afe_1143基因的開放閱讀框架的長度為1320 bp，編碼一個相對分子量為47 204.05 Da、等電點為9.64的膜蛋白，它的保守區域是 PRK09783，其功能還沒有完全確定，暫時被稱為 CusB(copper/silver efflux system membrane fusion protein)。CusB連接內膜外排泵CusA和外膜通道CusC介導對銅和銀的抗性，晶體結構顯示 CusB具有多個金屬離子結合位點[27]；afe_1144基因的開放閱讀框架的長度為3111 bp，編碼一個相對分子量為112 374.33 Da、等電點為9.34的12次跨膜的膜蛋白，它的保守區域是 COG3696，也被稱為推測的銀外排泵，參與無機離子的轉運和代謝。

3 結論

1)在不同濃度 Zn2+、Mn2+和 Cd2+的刺激下，以硫粉作為能源物質時，At.ferrooxidans DC菌株對Mn2+、Zn2+、Cd2+的最大耐受濃度分別是 0.38、0.18和0.08 mol/L，且隨著金屬離子濃度的增加，DC菌株的生長受到的抑制作用越大。

2)實驗結果表明：Mn2+、Zn2+和Cd2+對DC菌株毒害作用由大到小的順序依次為Cd2+、Zn2+、Mn2+。

3)在不同濃度 Mn2+、Zn2+和 Cd2+的刺激下，At.ferrooxidans DC菌株的4個基因(afe_0671、afe_0674、afe_1143和afe_1144)的相對表達量均呈上調趨勢，且隨著金屬離子濃度的增加，上調倍數增加，說明這 4個基因對于Mn2+、Zn2+和Cd2+的脅迫非常敏感，而且這 4個基因的相對表達量與金屬離子的濃度成正相關。

4)隨著金屬離子濃度的增加，基因的表達量升高，編碼外排系統的基因被誘導，由此推測這4個基因編碼的蛋白可能參與金屬離子的外排。結合以前的報道認為，afe_0671、afe_1143和afe_1144編碼的蛋白可能參與Zn2+、Mn2+、Cu2+及 Cd2+的外排，afe_0674編碼的蛋白可能參與Zn2+、Mn2+及Cd2+的外排，至于其是否參與Cu2+的外排還沒有報道過。

5)生物信息學分析表明，這4個基因編碼的蛋白轉運金屬離子或者參與金屬離子的轉運。基因afe_0671和afe_1144編碼的蛋白是參與金屬離子轉運的多次跨膜蛋白，基因afe_1143編碼的蛋白是位于細胞質膜上的金屬離子轉運體蛋白，基因afe_0674編碼的蛋白是一種參與Cu2+及Ag2+轉運的蛋白。

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