廣西柳州地區羅非魚鏈球菌病病原藥敏性分析

黃 杰 羅福廣 楊 軍 左 躍 易 弋 黃 稀

（1.柳州市漁業技術推廣站，廣西 柳州 545006；2.廣西工學院，廣西 柳州 545006；3.國家羅非魚產業技術體系柳州綜合試驗站，廣西 柳州 545002）

隨著羅非魚規模化養殖的不斷擴大，其苗種、水產品流通日趨頻繁，加上養殖環境的惡化和養殖戶規范用藥的意識薄弱，造成各種細菌病尤其是鏈球菌病在國內呈迅速蔓延趨勢，并嚴重制約羅非魚產業化的健康可持續發展。據國內外報道引發羅非魚病害的主要病原多為海豚鏈球菌（Streptococcus iniae）和無乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae）[1-6]，發病征兆除一部分為無明顯癥狀和病變的急性死亡外，大多數病魚都表現為眼突或眼球白色渾濁的典型癥狀[7]。

養殖戶針對細菌病的防治，一般是通過使用各種抗菌藥物。長期使用、濫用、亂用現象屢見不鮮，細菌耐藥問題日益突顯。通過細菌藥敏實驗實施針對單一型或者混合型細菌疾病的診療服務，在獸醫臨床診斷和指導用藥中已經普遍應用，而在水產養殖過程中，大多數還是采用傳統的細菌病防治方法。本文通過紙片擴散法（K.B法）[8]，從柳州地區患病羅非魚體內分離病原菌并進行藥敏性分析，為本地區鏈球菌病的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗對象

患病的羅非魚來自2012年廣西柳州地區10個暴發鏈球菌病的養殖場（編號依次為D1、D2……D10）。

1.2 實驗材料

血瓊脂平板、藥敏紙片分別購自鄭州安圖綠科生物工程有限公司、杭州天和微生物試劑有限公司。

1.3 病菌分離純化

對眼突、水面轉圈獨游等典型鏈球菌病癥狀羅非魚的腦、腎、肝、脾取樣，劃線接種血平板后室溫培養 24h，挑取鏡檢為鏈狀球菌的優勢菌落進行純化，得到11個菌株。菌株依次編號為C1、C2……C11，菌株采集和養殖場情況見表1。

1.4 藥敏試驗

純化培養后的細菌，無菌條件下用接種針刮取部分細菌小心均勻涂布到血瓊脂平板，用鑷子將藥敏紙片緊貼到培養基上，兩紙片中心距不少于25mm，紙片與邊緣距不少于15mm。室溫培養24h后測量抑菌圈大小，判定敏感度[9]。

表1 菌株采集和養殖場情況

2 結果

2.1 癥狀

長年均有發生，7～9月最為嚴重。病魚主要表現為浮頭、轉圈、獨游、蛙躍等，眼睛單側或雙側突出、白濁，部分體色發黑，肛門紅腫；解剖觀察肝呈土黃或蒼白色，膽、腎腫大，部分腹腔充水。

2.2 細菌分離和形態觀察

大多數病魚從腦、肝、腎接種24h后獲得色澤一致，在劃線位置形成細密排列的菌落。每個菌落圓形隆起，邊緣光滑呈乳白色，直徑0.5～2mm。革蘭氏染色發現均為陽性球菌，單個或鏈狀。

2.3 細菌藥敏試驗

本次試驗分離菌株對26種常見抗生素包括奎諾酮類、磺胺類、酰胺醇類、頭孢類等水產藥物或其他醫用藥物的敏感性檢測結果如表2所示，耐藥率在60%以上的有復方新諾明、鏈霉素、新霉素、氟哌酸、多粘菌素B、依諾沙星、磺胺二甲嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶（鈉）、磺胺對甲氧嘧啶等藥物，復方新諾明、磺胺對甲氧嘧啶表現為最高（90.9%）。而頭孢類、恩諾沙星、鹽酸沙拉沙星、復方磺胺嘧啶、氟苯尼考、青霉素等藥物則檢測有一定敏感的頻率，敏感率最高為青霉素 G（36.4%）。從單個菌株來看，C4、C5對檢測的26種藥物有普遍的耐藥程度，分別為92.3%和69.2%，耐藥程度在40%以上的菌株，均來源于采集菌株一周前投喂過各種抗生素的養殖場。同一池塘不同時期采集的菌株，其藥物敏感性試驗結果也不同，在分別投喂恩諾沙星，阿莫西林后，分離菌株C7檢測對26種藥物的耐藥率為46.2%，敏感率為0；停喂18天后分離菌株 C8檢測對 26種藥物的耐藥率為 15.4%，敏感率為53.9%。

表2 分離菌株對藥物敏感性的試驗結果

3 討論

羅非魚鏈球菌病是一種暴發性流行病，近年報道羅非魚鏈球菌感染的趨勢明顯增加，主要危害100g以上的幼魚和成魚，傳染性強，發病率達10%～30%，死亡率達25%～80%[5]，病害的發生多與水溫高、養殖密度大、水質差、投飼量大和飼料質量差有較大關系，嚴重危害羅非魚養殖業的健康發展[10]。近幾年年廣西柳州地區羅非魚鏈球菌病發生情況調查大致為：病害每年均有發生，水溫長時間高于28℃，養殖密度高、投喂過多飼料時通常會發生暴發性死亡，死亡以個體大、長速快的羅非魚居多。但調查發現了1例從海南引進3～4cm的苗種發生暴發性鏈球菌病急性死亡，說明鏈球菌病有向著感染幼魚方向發展的趨勢。

發生鏈球菌病后，養殖戶首先采用的是傳統防治方法，即使用各種水產抗生素藥物如恩諾沙星、諾氟沙星、氟苯尼考、鹽酸多西環素、復方磺胺二甲嘧啶粉等，但效果并不顯著。通過本試驗發現所有分離菌株均有一定程度的耐藥性，養殖戶選取的抗生素藥物有極大的概率對病原菌不起作用，這可能是養殖戶使用藥物治療無效的主要原因之一。試驗完成后，我們將實驗結果及時反饋給養殖戶，并根據結果為養殖戶用藥提供指導。采用了敏感藥物進行針對性治療后，死亡率大大降低。例如養殖戶在使用檢測敏感率高的水產青霉素藥物或其他有敏感性藥物3-5d后，每日死亡量為1、2尾或無，效果非常明顯。若出現鏈球菌病突然爆發，養殖戶來不及送樣進行藥敏分析的情況，可以選擇青霉素進行治療，因為在試驗藥物中各菌株對青霉素的敏感率最高。此外，試驗結果還發現，具有普遍耐藥性的菌株，均來自長期、過量投喂單一藥物，或者頻繁換用藥物的養殖場。因此，建議養殖戶不要無目的的亂使用抗生素藥物，而應在日常管理上通過注入地下井水、加深塘水、減少或不投喂餌料、適當分塘養殖、長時間增氧等方法來防治鏈球菌病，這樣不但可以防止“超級細菌”的產生，同時也能避免抗生素殘留帶來的問題。

藥敏試驗雖然能為養殖戶用藥提供科學指導，但仍有一定的局限性，例如水產病原菌藥敏試驗沒形成標準，抗菌藥敏試劑少(如缺乏中草藥藥敏試劑缺乏等)，藥敏試驗周期長（3d），需要一定的實驗室條件和操作技術。隨著國內水產藥敏試驗的重視和標準化的逐步建立，其條件、方法、效率等方面不斷改進，藥敏試驗將成為一種常規的水產養殖病害防治手段，普遍應用到現代化規模養殖中，科學指導和規范用藥，確保我國水產品質量安全和水產養殖業健康發展。

[1] Perera R P, Johnson S K, Collins M D, et al. Streptococcus iniae associated with mortality of Tilapia nilotica × T. aurea hybrids[J].Aquat Anim Health,1994,6(4):335-340.

[2] Pasnik D J, Evans J J, Klesius P H. Duration of protective antibodies and correlation with survival in Nile tilapia(Oreochromis niloticus) following Streptococcus agalactiae vaccination[J]. Dis Aquat Org, 2005,66(2):129-134.

[3] 譚晶晶,陳昌福,高宇,等.奧尼羅非魚無乳鏈球菌的鑒定、致病性及藥物敏感性研究[J].華中農業大學學報,2010,29(6):745-751.

[4] 黎炯,葉星,盧邁新,等.雙重PCR 快速鑒別無乳鏈球菌和海豚鏈球菌[J].湖南農業大學學報(自然科學版),2010,36(4):449-452.

[5] 張新艷,樊海平,鐘全福,等.羅非魚無乳鏈球菌的分離、鑒定及致病性研究[J].水產學報,2008,32(5):772-779.

[6] 柯劍,趙飛,羅理,等.廣東省羅非魚主養區無乳鏈球菌的分離、鑒定與致病性[J].廣東海洋大學學報,2010,30(3):22- 27.

[7] 李波,陳明,李莉萍,等.廣西羅非魚鏈球菌病病原的生化鑒定及藥敏試驗[J].中國畜牧獸醫,2008,35(10):93-95.

[8] 王輝,徐英春,陳民鈞.簡要介紹美國 NCCI.S藥敏試驗紙片擴散法法規(1993年 12月版)[J].中華醫學檢驗雜志,1995,18(1):50-62.

[9] 張正,高屹,葉應嫵. WS/T 125-1999中華人民共和國衛生行業標準,紙片法抗菌藥物敏感試驗標準[S].北京:中國標準出版社,2000.

[10] 盧邁新.羅非魚鏈球菌病研究進展[J].南方水產,2010,6(1):75-79.