不同扶正方對(duì)紅豆杉中10-去乙酰巴卡亭Ⅲ煎出量的影響

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(蘇州市中醫(yī)醫(yī)院，蘇州市中醫(yī)藥研究所，江蘇 蘇州 215009)

不同扶正方對(duì)紅豆杉中10-去乙酰巴卡亭Ⅲ煎出量的影響

王斐，張露蓉，許恒，江國榮*，李盠鍵

(蘇州市中醫(yī)醫(yī)院，蘇州市中醫(yī)藥研究所，江蘇 蘇州 215009)

目的:建立紅豆杉水煎液中10-去乙酰巴卡亭Ⅲ(10-DABⅢ)HPLC分析方法,觀察不同扶正方(養(yǎng)陰代表方、益氣代表方、溫陽代表方)對(duì)紅豆杉中10-DABⅢ煎出量的影響。方法：采用反相高效液相色譜法,C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)，流動(dòng)相為甲醇∶水(40∶60)，流速為1 mL/min，檢測(cè)波長為：227 nm，柱溫為25 ℃。結(jié)果:10-DABⅢ在20～400 μg/mL范圍內(nèi)峰面積與含量成線性關(guān)系(Y=6.501 5X+20.792，r=0.999 97),平均回收率為103.86%(RSD=1.83%)。紅豆杉組、紅豆杉配伍養(yǎng)陰代表方組、紅豆杉配伍益氣代表方組、紅豆杉配伍溫陽代表方組中10-DABⅢ的含量依次為(2.004±0.091)、(2.286±0.073 4)、(2.096±0.097)、(1.640±0.138)mg(n=3)。結(jié)論:不同扶正方對(duì)紅豆杉中10-DABⅢ煎出量存在明顯差異,可為紅豆杉臨床合理使用提供參考實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

紅豆杉;10-去乙酰巴卡亭Ⅲ(10-DABⅢ);扶正方;中藥配伍;高效液相色譜法

紅豆杉為紅豆杉科紅豆杉屬植物,又稱“紫杉”，我國有南方紅豆杉、東北紅豆杉等5個(gè)品種。近年來，人工栽培的紅豆杉資源豐富，其化學(xué)成分與野生南方紅豆杉相近[1]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究[2-6]發(fā)現(xiàn)，紅豆杉中除紫杉醇外,還有10-去乙酰巴卡亭Ⅲ(10-DABⅢ)、多糖等多種成分,也具有抗腫瘤作用。本實(shí)驗(yàn)以10-DABⅢ主要有效成分為考察對(duì)象，建立紅豆杉水煎液中10-DABⅢ的HPLC分析方法,觀察常規(guī)臨床劑量的紅豆杉與我院腫瘤科3個(gè)常用的扶正方(分別為養(yǎng)陰代表方、益氣代表方、溫陽代表方)配伍后的10-DABⅢ含量差異，以期為紅豆杉抗腫瘤臨床合理使用提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 1100LC高效液相色譜儀(G1311A四元泵、G1313A進(jìn)樣器、G1316A柱溫箱、G1315B紫外檢測(cè)器和G2170AA工作站，美國Agilent)；AG285型電子分析天平(瑞士Mettler Toledo)。

1.2 試藥 南方紅豆杉飲片購自于馬鞍山市上工中藥飲片有限公司(批號(hào)：100101)；養(yǎng)陰代表方由沙參、麥冬和五味子組成，益氣代表方由黃芪、黨參、白術(shù)、茯苓、炙甘草組成，溫陽代表方由附子、干姜、甘草組成，相關(guān)中藥飲片購自于蘇州市春暉堂藥業(yè)有限公司。10-DABⅢ標(biāo)準(zhǔn)品(中國生物藥品檢定所，32981-86-5)；甲醇(色譜純，Scharlab S.L.)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件[7]色譜柱：大連依利特Hypersil ODS C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相為甲醇∶水(40∶60)；流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長為227 nm,柱溫為25 ℃。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取10-DABⅢ標(biāo)準(zhǔn)品8.0 mg，置20 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為400 μg/mL的10-DABⅢ標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。精密量取上述標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.5、1.0、2.5、5.0 mL分別至10 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，得20、40、100、200 μg/mL的10-DABⅢ標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.3 供試品溶液的配制 紅豆杉組、紅豆杉配伍養(yǎng)陰代表方組、紅豆杉配伍益氣代表方組、紅豆杉配伍溫陽代表方組供試品的制備:精密稱取各組相應(yīng)的中藥適量(其中配伍方中的紅豆杉均為6 g)，加3倍量蒸餾水浸泡0.5 h，再加入5倍量水，回流提取1 h,過濾。取藥渣，再加入5倍量水，回流提取1 h，合并2次濾液。濾液濃縮適量，得到濃度為1 g(生藥量)/mL的濃縮液。4 ℃密封保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 陰性對(duì)照溶液的配制 精密稱取的養(yǎng)陰代表方、益氣代表方、溫陽代表方，按照2.3項(xiàng)下的提取方法制備。

2.5 系統(tǒng)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn) 見圖1。

A.10-DABⅢ標(biāo)準(zhǔn)品；B.紅豆杉水煎液；1.10-DAB Ⅲ圖1 紅豆杉中的10-DABⅢ色譜圖

圖1顯示，在此檢測(cè)條件下，10-DABⅢ出峰時(shí)間為20.355 min左右，色譜分離度良好，峰形較好，分離無干擾。

2.6 線性關(guān)系考察 分別吸取20、40、100、200、400 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)品溶液各5 μL注入液相色譜儀中，記錄峰面積。以10-DABⅢ的峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，以10-DABⅢ的含量(X)為橫坐標(biāo)，建立回歸方程Y=6.502X+20.792，相關(guān)系數(shù)r=0.999 97。結(jié)果表明10-DABⅢ在20～400 μg/mL范圍內(nèi)，峰面積與含量呈線性關(guān)系。

2.7 精密度試驗(yàn) 精密吸取濃度為100 μg/mL的10-DABⅢ對(duì)照品溶液5 μL,連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄峰面積，得RSD為0.54%(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.8 重現(xiàn)性試驗(yàn) 取紅豆杉6分，每分6 g，精密稱定。按照2.3項(xiàng)下制備。進(jìn)樣5.0 μL，記錄峰面積，結(jié)果紅豆杉中10-DABⅢ的平均含量為0.333 9 mg/g,RSD=4.48%(n=6)，表明本法重復(fù)性良好。

2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取紅豆杉6 g，精密稱定。按照2.3項(xiàng)下制備。分別于0、1、2、4、16、24 h進(jìn)樣5.0 μL，記錄峰面積，RSD為1.96%。說明供試品溶液中10-DABⅢ的含量在24 h內(nèi)的穩(wěn)定性。

2.10 回收率試驗(yàn) 取已知含量的紅豆杉6分，每分3 g，精密稱定，加入1 mg 10-DABⅢ標(biāo)準(zhǔn)品，照2.3項(xiàng)制備，進(jìn)樣5 μL。記錄峰面積。計(jì)算所得平均加樣回收率為103.86%，RSD為1.83%。說明用該方法測(cè)定10-DABⅢ的含量有較好的回收率。

2.11 不同扶正方對(duì)紅豆杉中10-DABⅢ煎出量的影響 紅豆杉配伍養(yǎng)陰代表方組、紅豆杉配伍益氣代表方組、紅豆杉配伍溫陽代表方組按2.3項(xiàng)下制備(n=3),養(yǎng)陰代表方、益氣代表方、溫陽代表方按2.4項(xiàng)下制備，再按2.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣，進(jìn)樣量5 μL，結(jié)果見表1。

組 別含量/mg增量/mg增量百分比/%紅豆杉組 2.004±0.0907--紅豆杉配伍養(yǎng)陰代表方組2.286±0.07350.28214.07紅豆杉配伍益氣代表方組2.096±0.09660.0924.59紅豆杉配伍溫陽代表方組1.640±0.1384-0.364-18.17

結(jié)果顯示：紅豆杉配伍養(yǎng)陰代表方組，紅豆杉配伍益氣代表方組峰分離完全，無干擾。紅豆杉配伍養(yǎng)陰代表方組中10-DABⅢ的含量明顯增加，紅豆杉配伍益氣代表方組中10-DABⅢ的含量略有增加，紅豆杉配伍溫陽代表方組中10-DABⅢ的含量明顯降低。提示:不同的配伍方藥對(duì)紅豆杉中10-DABⅢ煎出量的影響不同。

3 討論

中藥復(fù)方配伍講究“君臣佐使，協(xié)同作用”的配伍原則，同一中藥在不同方藥配伍下的劑量、作用等均有所不同。我院紅豆杉的抗腫瘤臨床用量為3～9 g，主要是與養(yǎng)陰法、益氣法、溫陽法的代表方配伍使用，初步觀察結(jié)果表明與養(yǎng)陰代表方或益氣代表方配伍使用的療效要優(yōu)于與溫陽代表方配伍使用。本文選擇了以紅豆杉6 g的臨床常用劑量進(jìn)行與3個(gè)扶正方配伍后的10-DABⅢ初步分析，配伍紅豆杉后，10-DABⅢ的含量依次為養(yǎng)陰代表方組gt;益氣代表方組gt;溫陽代表方組，這與臨床初步療效觀察基本一致。提示不同的配伍方藥對(duì)紅豆杉中10-DABⅢ煎出量有明顯的影響，可能是臨床抗腫瘤效應(yīng)差異的主要原因之一。

目前紅豆杉臨床使用以水煎劑為主的形式達(dá)到臨床治療作用。紫杉醇是從紅豆杉中最早發(fā)現(xiàn)的具有明確抗腫瘤作用的成分，但其幾乎不溶水。而10-DABⅢ具有較好的水溶性,在南方紅豆杉的不同部位(葉、枝等)均含有，是紅豆杉中含量較高的紫杉烷類化合物之一[7]，近期研究[5,8]表明，10-DABⅢ也具有抗腫瘤等多種活性作用。提示10-DABⅢ是紅豆杉飲片水煎液的主要抗腫瘤成分之一。

目前，紅豆杉中10-DABⅢ測(cè)定中樣本處理常規(guī)是醇提取[7],而10-DABⅢ的水溶性較好，前期預(yù)實(shí)驗(yàn)對(duì)水提取與醇提取方法進(jìn)行了比較，也顯示2種條件下紅豆杉中10-DABⅢ含量相近， 且紅豆杉水煎液中10-DABⅢ分離效果與文獻(xiàn)[7]一致。故本文在此基礎(chǔ)上建立紅豆杉水煎液中10-DABⅢ的HPLC分析方法。

本課題選用的3個(gè)代表方均為我院腫瘤科臨床使用的扶正方藥,與紅豆杉抑制腫瘤效應(yīng)成分進(jìn)行優(yōu)勢(shì)配伍，充分體現(xiàn)了中醫(yī)扶正祛邪的癌癥治療理念。進(jìn)一步對(duì)紅豆杉的抗腫瘤效應(yīng)成分，以及與扶正方藥合用時(shí)的成分變化、抗腫瘤效應(yīng)和作用機(jī)理的研究，將更有利于紅豆杉飲片的臨床合理利用。

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R285.4

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1007-4813(2013)03-0391-03

蘇州市2010年度科技發(fā)展計(jì)劃(社會(huì)發(fā)展)項(xiàng)目(編號(hào):SYSD2010166)。

王 斐(1979-)，女，碩士，工程師。研究方向：中藥分析與臨床藥學(xué)。

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江國榮,教授,碩士研究生導(dǎo)師,E-mail:guorongjiang@hotmail.com。

2013-01-04)