益氣消法中藥含藥血清對人臍靜脈內皮細胞株細胞增殖、遷移及凋亡的影響

劉麗麗，李 爽，李海東，宋卓敏

（1.天津中醫(yī)藥大學，天津 300193；2.天津醫(yī)科大學生物化學與分子生物學系，天津 300070；3.天津中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥研究院，天津 300193）

1 材料與方法

1.2 含藥血清制備 選SD大鼠，體質量（375±25）g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供。實驗前，置動物于室內適應環(huán)境，常規(guī)喂養(yǎng)1周。將體質量≥400g或者≤350g的SD大鼠予以剔除。共體質量相近的SD大鼠50只，按隨機數字表法分為4組：正常對照組、中藥高、中、低劑量組，每組10只。正常對照組：給予蒸餾水。中藥高、中、低劑量組：用藥劑量為根據人的日用藥量，按大鼠體表面積比率換算成等效劑量的2、1、0.5倍，具體數據分別為4、2、1g/kg干粉（相當于18、9、4.5g/kg生藥）。每次1mL/100g體質量，每天2次，間隔10h，連續(xù)灌胃5d，第5天上午灌服藥物后1h腹主動脈取血，離心處理后，取血清2mL左右，置于無菌試管中，56℃水浴滅活30min，0.22μm微孔濾膜過濾除菌，密封，-20℃冰箱中凍存。

1.3 實驗試劑和儀器 17β-雌二醇（美國Sigma公司）；ICI-182780（美國Sigma公司）。人臍靜脈內皮細胞（EA.hy926）購自中國科學院上海細胞庫，體外培養(yǎng)傳代；DMEM培養(yǎng)基（美國GIBCO）；優(yōu)質小牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）；MTT粉（北京天港邦定生物醫(yī)學科技有限公司）；二甲基亞砜（上海菲達有限公司）；青、鏈霉素（華北制藥股份有限公司）；流式細胞儀（FCM，Becton-dickinson公司）。

1.4 研究方法

1.4.1 細胞培養(yǎng) 人臍靜脈內皮細胞株（EA.hy926），接種于含10％小牛血清、100U/mL青霉素、100mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，在37℃、5％CO2、飽和濕度培養(yǎng)，至EA.hy926細胞生長成單層后備用。

1.4.2 細胞分組及干預 培養(yǎng)的EA.hy926細胞，隨機分為6組：正常對照血清組；17 β-Estradiol組（簡稱E2組）；E2加ICI 182，780組（簡稱E2加ICI組）；E2加中藥高劑量含藥血清組；E2加中藥中劑量含藥血清組；E2加中藥低劑量含藥血清組。用DMEM培養(yǎng)液配成終濃度為15％的含藥血清或對照血清，E2終濃度10-8mol/L，ICI終濃度10-7mol/L。

1.4.3 MTT法檢測EA.hy926細胞增殖 將對數生長期的EA.hy926細胞，胰酶消化后細胞計數，以5×105個/L濃度接種于96孔培養(yǎng)板，200μL每孔，常規(guī)培養(yǎng)過夜，使細胞貼附，孵育24h后，棄原培養(yǎng)液，換新鮮培養(yǎng)液，180μL每孔。根據實驗分組設計將不同濃度的含藥血清及試劑以每孔20μL量加入。繼續(xù)孵育48h后，每孔加入MTT 20μL，繼續(xù)孵育4h。傾去藥液及培養(yǎng)液，每孔加入二甲基亞砜150μL，振蕩10min，37℃繼續(xù)孵育，直至鏡下觀察二甲基亞砜全部溶解后，以自動酶標儀，490nm波長測定吸光度值（A值），每組6個復孔，重復實驗3次，取其平均值。

1.4.4 劃痕法檢查EA.hy926的遷移能力 將對數生長期的EA.hy926細胞，胰酶消化后細胞計數，以5×105個/L濃度接種于6孔培養(yǎng)板。常規(guī)培養(yǎng)過夜，使細胞貼附，孵育24h后，棄去培養(yǎng)基，用無血清培養(yǎng)基漂洗1次，此時用無菌的槍頭（tips）沿各孔中軸均勻劃一道裸露的無細胞帶，用PBS漂洗劃下的細胞2～3次。根據實驗分組設計加入無血清的DMEM培養(yǎng)液配制的不同濃度的含藥血清及試劑，每組均設6個平行孔，以這一時間點作為零時間點，后置于培養(yǎng)箱內繼續(xù)培養(yǎng)48h，分別在0、48h兩個時間點，在倒置顯微鏡下觀察同一位置的細胞遷移情況，拍照記錄。每孔隨即選擇測3個視野，取平均值計算細胞遷移數。重復實驗3次。

1.4.5 流式細胞術檢測EA.hy926細胞凋亡率 將對數生長期的EA.hy926細胞，胰酶消化后細胞計數，以5×105個/L濃度接種于6孔培養(yǎng)板，常規(guī)培養(yǎng)過夜，使細胞貼附，孵育24h后，棄原培養(yǎng)液，換新鮮培養(yǎng)液。根據實驗分組設計加入不同濃度的含藥血清及試劑。繼續(xù)孵育48h后，胰酶消化（無EDTA），迅速加入收集的培養(yǎng)液終止消化反應。1 500r/min離心5min，棄上清，收集細胞于10mL離心管中。4℃預冷的PBS洗2次。用PBS結合緩沖液重新懸浮細胞，調節(jié)其濃度為106細胞/mL。取200μL細胞懸液于5mL流式管中，加入5μL Annexin V-FITC（150mg/L）和5μL碘化丙錠（PI，120mg/L），混勻后室溫避光孵育15min，在反應管中加500μL PBS，流式細胞儀分析。重復實驗3次。

1.4.6 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件，數據用均數±標準差（±s）表示，多組間均數比較應用One-way ANOVA進行統(tǒng)計學分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 實驗結果

表1 各組EA.hy926細胞增殖、遷移數、細胞凋亡的比較（±s，n=18）

表1 各組EA.hy926細胞增殖、遷移數、細胞凋亡的比較（±s，n=18）

注：與正常組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與E2組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與E2加中藥高劑量組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

組 別 細胞增殖 細胞遷移數/個 細胞凋亡率/％正常對照血清組 0.433±0.044△△▲ 170.39±10.56△△▲▲ 8.021±0.641△△▲▲E2組 0.602±0.027##▲▲ 214.56±14.78##▲▲ 5.418±0.873##▲▲E2加ICI組 0.447±0.017△△▲▲ 174.39±10.98△△▲▲ 7.643±1.020△△▲E2加中藥高劑量含藥血清組 0.478±0.015△## 187.94±9.43##△△ 6.514±0.580##△△E2加中藥中劑量含藥血清組 0.521±0.022##△△▲▲ 199.39±14.59##△△▲ 5.333±0.950##▲▲E2加中藥低劑量含藥血清組 0.587±0.223##▲▲ 209.33±26.51##▲▲ 5.457±0.676##▲▲

如表1所示：正常組EA.hy926細胞的增殖低于E2組、E2加中藥中、低劑量組（P＜0.01）、E2加中藥高劑量組（P＜0.05），與E2加ICI組相比無顯著性差異（P＞0.05）；E2組高于除E2加中藥低劑量組外的其它各組（P＜0.01），與E2加中藥低劑量組比較無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；E2加中藥高劑量組EA.hy926細胞的增殖顯著低于E2加中藥中、低劑量組（P＜0.01），高于E2加ICI組（P＜0.01），E2加中藥中劑量組顯著低于E2加中藥低劑量組（P＜0.01）。

正常組EA.hy926細胞遷移數顯著低于E2組、E2加中藥高、中、低劑量組（P＜0.01），與E2加ICI組相比無顯著性差異（P＞0.05）；E2組高于除E2加中藥低劑量組外的其它各組（P＜0.01），與E2加中藥低劑量組比較無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；E2加中藥高劑量組低于E2加中藥中劑量組（P＜0.05）及E2加中藥低劑量組（P＜0.01），顯著高于E2加ICI組（P＜0.01），E2加中藥中劑量組低于E2加中藥低劑量組（P＜0.05）。

正常組EA.hy926細胞凋亡率顯著高于E2組、E2加中藥高、中、低劑量組（P＜0.01），與E2加ICI組相比無顯著性差異（P＞0.05），E2組顯著低于除E2加中藥中、低劑量組外的其它各組（P＜0.01），與E2加中藥中、低劑量組相比無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；E2加中藥高劑量組EA.hy926細胞凋亡率顯著高于E2加中藥中、低劑量組（P＜0.01），低于E2加ICI組（P＜0.05）；E2加中藥中劑量組與E2加中藥低劑量組比較無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

3 討論

本研究結果顯示，經E2處理的EA.hy926細胞，其增值、遷移明顯高于正常組，細胞凋亡率明顯低于正常組；而ICI和益氣消法中藥均可明顯阻斷E2對EA.hy926的細胞的增值、遷移的促進作用，阻斷E2對EA.hy926細胞的凋亡的抑制作用，與E2組比較有顯著差異（P＜0.01）。據現代藥理研究該方中多味中藥有抗腫瘤血管生成作用。黨參提取物對紫杉醇抑制血管生成和移植腫瘤轉移有一定的增強作用［2］。莪術油注射液對小鼠移植性S180肉瘤血管形成有抑制作用［3］。續(xù)斷有抑制子宮收縮、調節(jié)機體免疫、改善局部血循環(huán)、促進血腫的吸收機化、抗感染等藥理作用［4］。鱉甲有調節(jié)機體免疫、抗腫瘤、抗突變、抗纖維化等藥理作用［5］。白芥子有抗腫瘤、抗雄激素、抑菌等藥理作用［6］。郁金及其提取物有保護染色體突變的作用，對癌細胞有明顯的抑制作用［7］。此為益氣消法中藥干擾血管生成過程，抑制血管新生，從而抑制子宮肌瘤血管生長、肌瘤發(fā)展的原因之一。但其具體機制尚需進一步探討。

［1］哈孝賢，董素芹，劉永志，等.肌瘤丸治療子宮肌瘤的臨床研究：附384例病例報告［J］.天津中醫(yī)，1996，13（2）：1-3.

［2］柏長青，宋穎芳，王德堂，等.黃芪、黨參提取物增強紫杉醇抑制腫瘤血管生成和轉移的實驗研究［J］.細胞與分子免疫學雜志，2008，24（4）：375-377.

［3］馮剛，黃濤，盧宏達，等.莪術油注射液對小鼠移植性S180肉瘤血管形成的抑制作用［J］.腫瘤研究與臨床，2005，17（4）：233.

［4］晏媛，鄭萍.續(xù)斷的藥理學研究進展［J］.中醫(yī)藥研究，2002，18（5）：53-54.

［5］溫欣，周洪雷.鱉甲化學成分和藥理藥效研究進展［J］.西北藥學雜志，2008，23（2）：122-124.

［6］歐敏銳，吳國欣，林躍鑫.中藥白芥子研究概述［J］.海峽藥學，2001，13（2）：8-11.

［7］何必立，呂賓，徐毅，等.郁金對胃癌細胞的抑制作用及其對血管內皮生長因子表達的影響［J］.中醫(yī)藥學刊，2006，24（9）：1741-1743.