ANGⅡ誘導大鼠動脈內(nèi)皮細胞凋亡作用分子機制研究

周春剛，陸 曙，王書樂，張志斌

（南京中醫(yī)藥大學無錫附屬醫(yī)院 中心實驗室，江蘇 無錫214001）

研究表明，致動脈粥樣硬化的因素包括ANGⅡ、氧化修飾低密度脂蛋白及氧化應(yīng)激反應(yīng)等均能誘導內(nèi)皮細胞凋亡。內(nèi)皮細胞凋亡影響血管調(diào)節(jié)，致血管平滑肌細胞增殖和遷移，促進血液凝固，進而促進動脈粥樣硬化斑塊的形成與發(fā)展［1］。ANGⅡ作為內(nèi)皮細胞的主要促凋亡因子，其誘導細胞凋亡機制尚未完全闡明，本文通過ANGⅡ誘導體外培養(yǎng)大鼠動脈內(nèi)皮細胞株（RAOEC）細胞凋亡，探討其誘導凋亡機制。

1 材料和方法

1.1 大鼠動脈內(nèi)皮細胞細胞株（RAOEC R304－05）（上海拜力生物科技有限公司購買），DMEM高糖（GIBCO），10%FBS（GIBCO），4mM L－G（L－谷氨酰胺）（GIBCO），1mM 丙酮酸鈉（GIBCO），0.25%胰酶 （GIBCO）AngiotensinⅡ5mg（美國ENZO），纈沙坦（北京諾華制藥有限公司），PD123319（北京科海榮京生物科技有限公司），Annexin V／PI雙染流式細胞凋亡檢測試劑盒（美國BD），SYBR Prime－Script RT－PCR Kit Ⅱ 試 劑 盒 （TAKARA DRR083S），流式細胞儀（美國 BD），LightCycler480 PCR儀（德國 ROCHE），二氧化碳培養(yǎng)箱（美國NUAIRE）。

1.2 RAOEC細胞培養(yǎng)和處理 RAOEC細胞株生長在含有10%胎牛血清，4mM L－G，1mM丙酮酸鈉，100U／ml青霉素，100μg／ml鏈霉素的 DMEM高糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)，37℃5%CO2的二氧化碳培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。取對數(shù)生長期RAOEC細胞，每孔接種8×104個細胞，ANGⅡ（10－5M，10－6M，10－7M，10－8M，10－9M），10－7M ANGⅡ（6h、12h、18h、24 h、48h），10－5M 纈沙坦和10－5M PD123319實驗組均設(shè)復(fù)孔，每個實驗需重復(fù)3－4次。

1.3 流式細胞儀檢測細胞凋亡 取1×106個細胞，1ml 4%多聚甲醛（PFA）固定20min，PBS洗2次，棄上清，沉淀細胞分2管，作為Annexin V和PI單陽性對照以調(diào)節(jié)熒光補償。每個實驗組細胞用冷PBS洗2次，0.25%胰酶消化處理，Annexin V 和PI標記后進行流式檢測。

1.4 逆轉(zhuǎn)錄和實時熒光定量PCR及溶解溫度曲線（Tm）分析 實時熒光定量PCR采用兩步法，管家基因β－actin作為內(nèi)參基因，目的基因和內(nèi)參基因引物序列見表1，由上海博彩生物科技有限公司合成。目標DNA擴增結(jié)束后再運行熔解程序，溶解曲線分析采用LightCycler Relative Quantification（Version 1.5）軟件，用于產(chǎn)物的特異性分析，2%瓊脂糖凝膠電泳亦用于擴增產(chǎn)物的大小及特異性鑒定。

1.5 相對定量分析 相對定量分析采△△CT法，標準化比值計算公式采用2－△△CT［2］。以未加 ANGⅡ?qū)φ湛准毎鳛樾势罚╟alibrator），實驗組mRNA水平與校準品mRNA水平比較的相對比值作為定量值。

1.6 統(tǒng)計方法 數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用統(tǒng)計軟件SPSS11.5處理，數(shù)值用均數(shù)±標準差表示，兩組間差異統(tǒng)計性分析采用Student’st－test，P＜0.05具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 流式細胞儀檢測ANGⅡ誘導RAOEC細胞凋亡率 結(jié)果顯示10－6M和10－7M ANGⅡ誘導內(nèi)皮細胞24h凋亡率為20%－30%，與空白對照組比較，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而更高或者更低濃度的 ANG Ⅱ（10－5M，10－8M，10－9M）并沒有引起更高的凋亡率。10－7M ANGⅡ誘導內(nèi)皮細胞6h和48h凋亡率分別為（13.2±1.25）%和（16±2.11）%，而12h－24h凋亡率顯著升高，凋亡率為25%－27%，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），AT1R特異性受體拮抗劑纈沙坦干預(yù)ANGⅡ（10－7M）誘導內(nèi)皮細胞凋亡組24h凋亡率為（19.28±2.23）%，AT2R特異性受體拮抗劑PD123319組凋亡率為（14.24±1.74）%，纈沙坦和PD123319聯(lián)合干預(yù)內(nèi)皮細胞凋亡率為（6.27±1.44）%，與未加拮抗劑的ANGⅡ組［凋亡率（34±1.86）%］差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.2 RT－qPCR產(chǎn)物電泳及Tm曲線分析（表1）目的基因及內(nèi)參基因的PCR產(chǎn)物經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結(jié)果顯示擴增產(chǎn)物均為單一條帶，無引物二聚體形成。擴增產(chǎn)物具有單一明顯而尖削的峰圖說明產(chǎn)物的特異性，不同的基因片段具有不同的Tm。每一個Tm對應(yīng)一個溶解曲線峰。

2.3 RT－qPCR熒光相對定量凋亡信號轉(zhuǎn)導途徑相關(guān)分子mRNA表達水平（圖1，圖2）

與未加ANGⅡ的對照孔比較，10－7M ANGⅡ24hAT1R和AT2RmRNA表達水平顯著上調(diào)，分別為2.48±0.562和2.14±0.290，F(xiàn)as、caspase 8、caspase9和BAX mRNA表達水平顯著上調(diào)，分別為2.058±0.234，1.93±0.377，2.022±0.157，2.037±0.035，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。FasL、Bcl－2、XIAP mRNA表達水平略有上調(diào)，相對值分別為1.602±0.592，1.298±0.342，1.216±0.272，細胞Fas－相關(guān)性死亡結(jié)構(gòu)域樣白介素－1β轉(zhuǎn)換酶抑制蛋白（c－FLIP）mRNA 表達水平為1.044±0.189，但差異均不具有統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。caspase8／c－FLIP比值 及Bcl－2／BAX比值分別為1.849±0.462和0.541±0.265，與未加 ANG Ⅱ的對照孔比較差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

圖1 ANGⅡ誘導RAOEC凋亡ATR及Fas／FasL死亡途徑相關(guān)凋亡蛋白mRNA表達水平

圖2 ANGⅡ誘導RAOEC凋亡ATR及胞內(nèi)線粒體途徑相關(guān)凋亡蛋白mRNA表達水平

表1 目的基因和內(nèi)參基因引物序列及產(chǎn)物特征

3 討論

細胞凋亡兩個主要途徑，胞外死亡受體途徑和胞內(nèi)線粒體途徑，并不是孤立存在，不同水平受多種調(diào)控因子控制，多種促凋亡分子與抑制凋亡分子相互作用，構(gòu)成多種分子共同作用的復(fù)雜調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)［4］。在ANGⅡ誘導凋亡模型中，隨凋亡率增加Fas和caspase 8mRNA 水平顯著升高，caspase 8／c－FLIP比值升高，胞內(nèi)線粒體途徑中BAX、caspase 9mRNA水平顯著上調(diào)，Bcl－2／BAX比值顯著降低。由此可見，ANGⅡ誘導大鼠動脈內(nèi)皮細胞凋亡與Fas、caspase 8、BAX和caspase 9上調(diào)有關(guān)，表明兩個凋亡途徑均有參與，而我們的研究結(jié)果尚需在蛋白水平進一步證實。

ANGⅡ的生物學作用依賴細胞類型的不同，通過活化其受體AT1R和AT2R促進生長或凋亡［5－9］。我們在對ANG Ⅱ誘導大鼠動脈內(nèi)皮凋亡模型研究發(fā)現(xiàn)，ANGⅡ誘導大鼠動脈內(nèi)皮凋亡作用具有時間和劑量依賴性，高濃度和低濃度或者延長作用時間都不能增加凋亡率，與相關(guān)研究報道一致［10］，不同ANG Ⅱ濃度誘導凋亡率與AT1R和AT2RmRNA表達水平呈直線相關(guān)，隨凋亡率增加，AT1R和AT2RmRNA表達水平上調(diào)，纈沙坦和PD123319分別單獨干預(yù)后，凋亡率減低，AT1R和AT2RmRNA表達水平均顯著下調(diào)，而單獨應(yīng)用均不能完全抑制ANGⅡ誘導內(nèi)皮凋亡，可能是AT受體與相應(yīng)拮抗劑結(jié)合后，ANGⅡ通過另一AT受體，起到促凋亡作用，而聯(lián)合應(yīng)用則能完全抑制其誘導的內(nèi)皮細胞凋亡，結(jié)果表明AT1R和AT2R信號轉(zhuǎn)導途徑參與ANGⅡ誘導內(nèi)皮凋亡。ANGⅡ作為RAAS系統(tǒng)重要的促凋亡因子，內(nèi)皮細胞凋亡加速動脈粥樣硬化的形成和發(fā)展，ANGⅡ受體拮抗劑可能通過保護內(nèi)皮細胞，預(yù)防動脈內(nèi)皮細胞凋亡導致血管重塑，抑制粥樣斑塊形成和發(fā)展。故闡明ANGⅡ在死亡信號傳導通路級聯(lián)關(guān)鍵調(diào)節(jié)點的作用機制，對尋找針對這些關(guān)鍵調(diào)節(jié)點具有特異性抑制作用藥物或其他措施，為臨床藥物治療和預(yù)防開拓思路具有重要意義。

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