新疆塔吉克族健康人群脂蛋白脂酶HindⅢ基因多態(tài)性研究

祖克拉·肉孜，伊力哈木·乃扎木，宋曼殳，多力坤·買買提玉素甫＊

（1.新疆大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆 烏魯木齊830046；2.首都醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生與家庭醫(yī)學(xué)學(xué)院）

脂蛋白脂酶（lipoprotein lipase，LPL）是由脂肪細(xì)胞、心肌細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞等實質(zhì)細(xì)胞合成和分泌的一種配置甘油水解酶，可將極低密度脂蛋白和乳糜微粒的甘油三酯（TG）水解為分子量較小的脂肪酸，從而血液甘油三酯濃度降低。LPL基因全長30 kb，含有9個內(nèi)含子和10個外顯子［1］，第8位內(nèi)含子的HindⅢ酶切位點的多態(tài)性使LPL基因有三種基因型。LPL是基因突變最為豐富的蛋白質(zhì)之一，其突變位點涉及外顯子、內(nèi)含子和啟動子，目前已經(jīng)證實LPL突變已達110余種。LPL基因多態(tài)性通過影響LPL活性，導(dǎo)致脂質(zhì)代謝和糖代謝紊亂，從而與高脂血癥、Ⅱ型糖尿病、高血壓、動脈硬化、肥胖及冠心病等疾病的發(fā)病風(fēng)險相關(guān)聯(lián)［2，3］。因此，研究LPL基因，對于探索這些疾病的相互關(guān)系、發(fā)病機理及其防治都具有積極的意義。近年來對LPL基因多態(tài)性研究發(fā)現(xiàn)，不同種族間基因多態(tài)性的分布可能存在差異，有關(guān)LPL基因HindⅢ多態(tài)性分布在中國老年人群、白種人、日本人中差異有報道［4］，但有關(guān)新疆地區(qū)塔吉克族健康人群LPL基因HindⅢ酶切位點多態(tài)性分布的研究目前尚未見研究報道。本研究分析了塔吉克族人群中LPL基因多態(tài)性的分布，為進一步研究LPL基因多態(tài)性與相關(guān)疾病發(fā)病危險性和前瞻性研究提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象

在塔吉克族正常人群中經(jīng)過體格檢查及輔助檢查，選取塔吉克族91人（男36例，女56例）。年齡15－90歲，平均年齡為42歲。對調(diào)查對象進行詳細(xì)詢問按項目內(nèi)容逐項填寫，病史詢問主要排除高血壓病，糖尿病，心腦血管疾病，腫瘤等目前被證實與遺傳有關(guān)的疾病。

1.2 方法

應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）等技術(shù)檢測無血緣關(guān)系的91例（男性36，女性55）塔吉克族LPL基因多態(tài)性，并結(jié)合統(tǒng)計學(xué)軟件分析其分布特點。

1.2.1 基因組DNA提取 取4℃下保存的含EDTA血樣，加入淋巴細(xì)胞提取液，進行淋巴細(xì)胞分離，具體操作按說明書進行（淋巴細(xì)胞提取液購于鼎國公司）。然后采用鹽析法從分離的淋巴細(xì)胞中提取DNA。

1.2.2 PCR 擴增 參照文獻［5］設(shè)計引物。HindⅢ上游引物：5’－TTCGCCATTCAGAAGATCAG－3’，下游引物：5’－GTGATACAAGCAAATGACTAAAG－3’；引物由上海生工合成。PCR試劑盒購于TaKaRa公司，PCR反應(yīng)體系為25μl，其中包含100ng基因組DNA，1UTaq DNA聚合酶，引物各10pmol／L，4×dNTP（10mmol／L）為2.5μl，10×PCR buffer為2.5μl，MgCl2（25mmol／L）為1.5μl，加去離子水補至終體積25μl。反應(yīng)條件：94℃4min預(yù)變性，94℃90s，52℃60s，70℃90s，循環(huán)次數(shù)40次；70℃延伸5min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色檢測擴增結(jié)果。

1.2.3 基因分型 PCR產(chǎn)物用HindⅢ限制性內(nèi)切酶酶切，37℃消化過夜，消化片段經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色后，凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio－Rad Gel Dox XR）拍照并判斷酶切結(jié)果。

1.2.4 酶切產(chǎn)物電泳 取PCR擴增產(chǎn)物5μl，在1.5%的瓊脂糖凝膠中電泳，在紫外照射儀上觀察結(jié)果。

1.2.5 統(tǒng)計學(xué)分析 經(jīng)過Hardy Weinberg遺傳平衡定律檢驗各基因型頻率是否達遺傳平衡［6］，具有群體代表性。利用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析，基因型分布及等位基因頻率比較用χ2檢驗。

2 結(jié)果

2.1 電泳結(jié)果

由圖1可見，LPL基因HindⅢ位點PCR擴增片段為645bp，經(jīng)HindⅢ限制性內(nèi)切酶水解后可得三種長度的多態(tài)性片斷，H＋H＋基因型（645bp，無HindⅢ酶切位點）；H＋H－基因型（645bp，528 bp，117bp）；H＋H＋基因型（528bp，117bp）。

圖1 脂蛋白酯酶基因HindⅢ 酶切位點多態(tài)性

2.2 基因型頻率

由表1可知兩組人群LPL基因型及等位基因頻率經(jīng)χ2檢驗，比例符合Hardy－Weinberg遺傳平衡定律，具有群體代表性。男女間基因型和等位基因頻率分布均無顯著性差異（P＞0.05）。

表1 塔吉克族91例健康人群LPL HindⅢRFLP分布

2.3 不同地區(qū)（不同民族）健康人群LPL HindⅢ位點基因型分析

由表2可知：廣西人與吉林漢族人比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（基因型：χ2＝0.652，P＝0.722等位基因：χ2＝0.639，P＝0.024）。廣西壯族人與朝鮮族比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（基因型：χ2＝7.786，P＝0.032等位基因：χ2＝8.784，P＝0.003）。吉林漢族人與塔吉克族人比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（基因型：χ2＝2.90，P＝0.235等位基因：χ2＝2.996，P＝0.083）。朝鮮族與塔吉克族人比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（基因型：χ2＝0.893，P＝0.640等位基因：χ2＝0.804，P＝0.370）。

表2 不同地區(qū)（不同民族）人群LPL HindⅢ位點基因型和等位基因頻率

2.4 不同種族之間健康人群LPL基因HindⅢ位點基因頻率比較

由表3可知：本文研究與法國，英國，印度等人群相關(guān)資料比較發(fā)現(xiàn)，不同種族間以基因型和等位基因頻率均存在極顯著差異（P＜0.01）［10－13］。而與美國［9］，韓國人［14］比較均有顯著性差異（P＜0.05）。而與丹麥［7］，日本人［8］比較均無顯著性差異（P＞0.05）。

表3 不同種族健康人群中LPL HindⅢ位點基因型和等位基因頻率分布的比較

3 討論

隨著分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)研究的不斷深入人們已經(jīng)認(rèn)識到基因的多態(tài)性可以造成某些疾病不同的易感性，對于人類基因多態(tài)性的研究可以了解各種基因的不同基因型在人群中的分布，有助于我們從基因水平更深刻的闡明各種疾病在不同種族，不同人群中存在不同發(fā)病率和不同臨床特點的內(nèi)在機制。LPL是脂質(zhì)代謝中的關(guān)鍵酶，在富含TG精蛋白代謝過程中起主要作用。其基因具有易突變性和明顯的多態(tài)性，多態(tài)性變異可能會影響LPL的含量及活性，從而影響TG代謝和血漿脂蛋白的水平［15］。HindⅢ位點在LPL基因的變異位點中比較常見，是由一個T→G堿基置換引起HindⅢ酶切位點缺失導(dǎo)致的多態(tài)性，有酶切位點定為 H＋，無HindⅢ 酶切位點定為 H－，產(chǎn)生3種基因型 H＋H＋、H＋H－、H－H－［16］。關(guān)于LPL過去幾十年的研究提高了我們對LPL結(jié)構(gòu)與功能、突變與疾病的認(rèn)識。LPL基因突變與糖尿病、高血壓、肥胖、動脈硬化等都有一定的相關(guān)性。因此，基因多態(tài)性的研究是解釋多種疾病臨床表現(xiàn)多樣化的一個有力工具。而在對一些致病基因的多態(tài)性分布進行研究時，首先了解其在正常人群中的分布特點是正確分析基因多態(tài)性與疾病之間關(guān)系的前提條件。

本研究應(yīng)用PCR－RFLP方法分析了新疆地區(qū)91例健康塔吉克族人群LPL基因HindⅢ位點基因多態(tài)性的遺傳分析，并將美國［9］，法國［10］，英國［11，12］，韓國［14］，印度［13］等人群基因多態(tài)性研究結(jié)果與本研究比較發(fā)現(xiàn)，基因型和等位基因頻率均存在顯著差異（P＜0.01，P＜0.05），而與吉林［16］，廣西地區(qū)人群［17］基因型分布相似（P＞0.05），以上結(jié)果符合遺傳學(xué)規(guī)律，即親緣關(guān)系越遠(yuǎn)，其基因型分布越顯著，這可能種族和地域的差別所致。因此我們認(rèn)為造成這種差異不僅是由于不同種族之間生活環(huán)境和生活習(xí)慣的不同所致，不同的基因背景也是其中不可忽視的一個重要原因。

總之，了解我國塔吉克族人群中該基因遺傳多態(tài)性的分布特點對認(rèn)識一些疾病在不同種族間表現(xiàn)出來的差異具有重要意義，也為進一步的群體遺傳學(xué)的研究和基因多態(tài)性普查奠定了基礎(chǔ)，并為進行疾病前瞻性研究提供了重要的基礎(chǔ)資料。

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