初步探討口腔鱗狀細(xì)胞癌中的p33／ING1表達(dá)的意義

王曉峰，張?zhí)旆颍?偉，劉 新

（吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 口腔科，吉林 長(zhǎng)春130033）

通過人們長(zhǎng)期對(duì)癌基因和抑癌基因的研究結(jié)果表明，從本質(zhì)上來說，腫瘤是一種多基因病，其中抑癌基因可能是阻止腫瘤發(fā)生的一種保護(hù)機(jī)制。近年在對(duì)口腔鱗癌的研究中發(fā)現(xiàn)一種新抑癌基因ING1，它與p53關(guān)系密切，有協(xié)同作用。為了探討ING1與口腔鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，本研究采用體外細(xì)胞培養(yǎng)，間接免疫熒光等技術(shù)觀察p33／ING1的表達(dá)情況，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料

30例正常組織取自智齒拔除術(shù)和唇裂手術(shù)切除等新鮮標(biāo)本，均經(jīng)病理證實(shí)無異常增生改變；30例異常增生組織取自吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院口腔科口腔鱗癌手術(shù)切除新鮮標(biāo)本，原發(fā)灶，患者未經(jīng)放、化療治療，取材范圍參考口腔腫瘤常規(guī)手術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，距肉眼可見癌組織0.5－1.0cm之間，并經(jīng)病理切片證實(shí)有異常增生而沒有癌變的組織；口腔鱗狀細(xì)胞癌組織取自我院收治的30例口腔鱗狀細(xì)胞癌患者，經(jīng)病理證實(shí)有癌變。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 口腔黏膜上皮細(xì)胞原代培養(yǎng) 無菌條件下所取的口腔黏膜組織立即保存于無菌液中，經(jīng)過處理后制成細(xì)胞懸液，接種于12孔培養(yǎng)靜置培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)至培養(yǎng)板的80%時(shí)開始傳代，以1∶2或1∶3的比例接種于培養(yǎng)板中繼續(xù)培養(yǎng)。傳代后培養(yǎng)12h，待細(xì)胞長(zhǎng)至80∶90%進(jìn)行細(xì)胞鋪片，用于免疫熒光。

1.2.2 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)方法 取第二代細(xì)胞制細(xì)胞爬片，PBS洗滌3次后，4%的多聚甲醛溶液固定30min，0.1%Trtion－100（pH＝7.2）室溫下處理10min。用廣譜單克隆角蛋白抗體及SP免疫組化試劑盒按試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.3 觀察指標(biāo)

激光共聚焦熒光顯微鏡下觀察，p33／ING1陽(yáng)性細(xì)胞為胞核及胞膜上出現(xiàn)翠綠色的顆粒，密度均勻、致密。隨機(jī)選擇10個(gè)視野，對(duì)p33／ING1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)，由此得出陽(yáng)性細(xì)胞的百分比。熒光染色結(jié)果做如下分類：＞50%為“＋＋”，10%－50%為“＋”，＜10%為“－”。分析時(shí) “＋”、“＋＋”歸為陽(yáng)性表達(dá)；“－”歸為低表達(dá)或不表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

檢測(cè)結(jié)果用SPSS11.00軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各組的p33／ING1陽(yáng)性細(xì)胞百分率進(jìn)行計(jì)數(shù)資料的χ2檢驗(yàn)，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

30例NOK和30例DOK中p33／ING1蛋白表達(dá)多為陽(yáng)性表達(dá)且多為“＋＋”（見圖1，圖2），陽(yáng)性率為100%及93.3%；30例OSCC中p33／ING1蛋白多為低表達(dá)或不表達(dá)（“＋”或“－”）（見圖3），陽(yáng)性率26.7%，兩者存在顯著性差異，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

圖1 NOK中P33／ING1強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)（×200）

圖2 DOK中P33／ING1陽(yáng)性表達(dá)（×200）

圖3 OSCC中P33／ING1低表達(dá)（×200）

表1 p33／ING1在NOK、DOK和OSCC中表達(dá)的情況

3 討論

Garkavtsev等在1996年研究發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的抑癌基因ING1，命名為p33／ING1。該蛋白與多種惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展關(guān)系密切，近年來已在人體多種腫瘤（乳腺癌、胃癌和頭頸部鱗癌等）中發(fā)現(xiàn)p33／ING1的突變。口腔鱗狀細(xì)胞癌是最常見的口腔惡性腫瘤，發(fā)病率高，生存質(zhì)量差。目前研究表明，口腔鱗癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多基因多因素相互作用的過程，其中抑癌基因的失活、缺失在導(dǎo)致腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著舉足輕重的作用。在口腔鱗癌中，多數(shù)研究發(fā)現(xiàn)p33／ING1與p53之間有協(xié)同作用[1－3]。

本研究應(yīng)用細(xì)胞原代培養(yǎng)方法及間接免疫熒光技術(shù)檢測(cè)p33／ING1在口腔鱗癌發(fā)生發(fā)展中的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，NOK和DOK細(xì)胞中均可檢測(cè)到p33／ING1蛋白的表達(dá)，其表達(dá)主要定位于胞核及胞膜上，其中NOK細(xì)胞中p33／ING1染色尤以胞核中更強(qiáng)，偶見于胞漿；OSCC細(xì)胞中p33／ING1抗體染色微弱，主要分布于胞漿。ING在NOK細(xì)胞中p33／ING1基因的表達(dá)要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于在OSCC細(xì)胞中的表達(dá)，有顯著差異，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），因此我們推測(cè)p33／ING1的低表達(dá)或不表達(dá)可能與口腔鱗癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，可作為口腔鱗癌早期發(fā)現(xiàn)和診斷的一種生物學(xué)指標(biāo)。另有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)[4，5]，p33／ING1蛋白的陽(yáng)性表達(dá)和胃癌分化程度具有相關(guān)性，分化越低，其陽(yáng)性表達(dá)率越低。p33／ING1蛋白與口腔鱗狀細(xì)胞癌之間是否也有這種相關(guān)性，仍需進(jìn)一步的研究。此外，p33／ING1蛋白在OSCC細(xì)胞中的低表達(dá)是否是由于其它抑癌基因的啟動(dòng)而抑制了p33／ING1基因的表達(dá)，也需要進(jìn)一步的研究證明。

總之，p33／ING1在口腔鱗癌的發(fā)生發(fā)展中可能起著一定的作用，為判斷口腔黏膜上皮癌變過程及阻斷、治療提供新思路。但是腫瘤的發(fā)生是多基因多因素共同作用的結(jié)果，p33／ING1基因的表達(dá)是否與其他抑癌基因、癌基因和凋亡相關(guān)基因等有關(guān)系[6]，還有待進(jìn)一步研究。

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