SCID小鼠腹腔內人B細胞非霍奇金淋巴瘤模型的建立

華映坤，曾 蓉，撒亞蓮，趙仁彬，鄒云蓮，陸 潔，嚴新民，史克倩，沈曉梅

（云南省第一人民醫院 臨床基礎醫學研究所 血液科，云南 昆明650032）

B細胞淋巴瘤（B lymphoma）是源于濾泡生發中心的惡性腫瘤，復發及耐藥是治療失敗的主要原因，尋找有效的診治方法是當前的主要任務［1］。

建立荷瘤鼠模型對探討腫瘤的病因、發病機制及制定診治策略具有重要價值［2，3］。有學者已建立淋巴瘤模型［4，5］，為客觀評估本實驗室后續的研究結果，需建立自己的疾病模型數據。目前尚無SCID小鼠腹腔Namalwa細胞株－人B細胞淋巴瘤模型的報道。本研究通過在SCID小鼠腹腔接種Namalwa細胞，探索建立人B細胞淋巴瘤模型的條件及其腫瘤生長特性，觀察荷瘤鼠的發病情況和生存時間，為研究B細胞淋巴瘤提供載體信息及搭建技術平臺。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 Namalwa細胞株為本研究所凍存。

1.1.2 實驗動物 SCID小鼠16只，雌性、雄性各半，4－5周齡，體重16－20g，購自北京維通利華實驗動物有限責任公司。飼養和實驗均在昆明醫學院云南省天然藥物重點實驗室的SPF動物層流室內進行。

1.1.3 試劑和耗材 RPMI－1640購自 TakaRa公司。小牛血清購自Hyclone公司。免疫組織化學試劑購自福建邁新生物技術公司（一抗為鼠抗人的單克隆抗體）。流式標記CD19抗體購自BD公司。石蠟包埋切片及HE染色所用試劑為國產分析純，塑料培養瓶、培養板均為Corning公司產品。

1.1.4 儀器 CO2培養箱（Forma Therapeutics Inc.，USA）；倒置顯微鏡（Nikon，Japan）；Shuang Lu冰箱 （BCD－230）；國產低速自動平衡離心機（LDZ 5－2）；流式細胞儀（Beckman－coulter EPICSXL，Immuno－Trul，USA）；SW－CJ－1F標準型型凈化工作臺（吳江市綠島凈化設備廠）；普通光學顯微鏡（重慶光學儀器廠）。

1.2 方法

1.2.1 Namalwa細胞系的培養及鑒定 迅速從液氮罐取出Namalwa細胞凍存管，放入38℃水浴中，不停搖動，使其快速融化，將細胞懸液轉移到含培養液的離心管中，500g離心5min，棄上清，用含15%小牛血清（滅活補體）的RPMI－1640培養液重懸Namalwa細胞，置37℃，50ml／L CO2培養箱中培養。收集1×106細胞用流式細胞儀檢測細胞膜表面分子CD19的表達。

1.2.2 人B細胞淋巴瘤SCID小鼠腹腔模型的建立 離心收集對數生長期的Namalwa細胞，用生理鹽水懸浮細胞，每只小鼠經腹腔接種7.5×106個細胞（0.5ml）。

1.2.3 荷瘤鼠的發病情況及其臟器累及情況 觀察荷瘤鼠的毛發、活動狀態及腫瘤的生長情況。待荷瘤鼠自然死亡或瀕死時處死并解剖觀察臟器浸潤情況，將瘤塊及侵犯的臟器：肝、脾、胰、腎、肺、胃、腸、盆腔臟器、鄰近的肌肉和皮膚等器官進行病理檢查。

1.2.4 病理形態學檢查 常規4μm厚的石蠟切片和HE染色法。

1.2.5 免疫組化 用MaxvisionTM 2試劑盒檢測CD79a，CD20，Ki－67和 CD3在瘤組織中的表達，DAB顯色。結果判斷：CD79a，CD20和CD3以胞膜著色為陽性，Ki－67以胞核著色為陽性。

2 結果

2.1 Namalwa細胞形態及CD19的表達

Namalwa細胞體積中等，圓形，折光性強，以細胞克隆團和散在單個細胞相間存在；流式細胞術檢測細胞膜表面表達CD19的陽性率為98.8%（圖1）。

圖1 Namalwa細胞的鏡下形態及細胞膜表型

2.2 人B細胞淋巴瘤SCID小鼠腹腔模型的建立

16只SCID小鼠有14只成瘤，成瘤率87.5%，中位成瘤時間為（18.67±1.94）d，中位生存期為（28.00±6.36）d。腹腔接種Namalwa細胞株后5－7d，SCID小鼠頭頂部出現豎毛、精神萎靡、行動遲緩，活動減少，腹部包塊，后期出現腫塊處皮膚破潰，所在側的后肢行走困難。一般情況隨荷瘤時間的延長不斷惡化。腫塊大小為（1.5－3.0）cm×（0.5－1.5）cm（圖2）。

2.3 病理學觀察

荷瘤鼠腹部瘤塊多為圓形或橢圓形結節，局部有壞死，邊界尚清楚，有黏連。瘤體剖面呈灰白色，質細柔，魚肉狀，易碎。瘤細胞密集排列、均勻一致（部分標本瘤細胞相互粘連成片），呈現異型，間質極少。瘤細胞體積中等，胞漿少。胞核中等大，染色質較細致（有泡狀），核仁較小，一個至數個，嗜堿性，核分裂活躍。許多瘤細胞發生碎屑性壞死。在腸、胃、肝、脾、腎、肺、胰、盆腔及鄰近肌肉和皮膚有瘤細胞浸潤，肝臟出現變性及局灶壞死（圖3）。

圖2 荷瘤的SCID小鼠和瘤組織

圖3 瘤組織及瘤細胞浸潤各組織的HE染色情況

2.4 瘤組織的免疫組織化學結果判斷

CD79a在胞膜和Ki－67在胞核有彌漫的棕黃色陽性物質（圖4－A，B）。CD20在胞膜有散在的棕黃色的陽性物質（圖4－C）；CD3染色未見棕黃色的陽性物質（圖4－D）。陰性對照未見棕黃色陽性物質。

3 討論

制備小鼠腫瘤模型可選用免疫功能健全的小白鼠、細胞免疫功能缺陷的裸鼠及細胞免疫－體液免疫聯合缺陷的SCID小鼠等［6］，本研究考慮到后續開展細胞過繼免疫治療的研究，為避免荷瘤鼠自身免疫的干擾，我們選用SCID小鼠制備淋巴瘤模型。瘤細胞常接種在皮下、腹腔或經血液播散成瘤。瘤體生長在皮下便于觀察，但Hoyle等報道，淋巴瘤細胞株在小鼠皮下較難成瘤，需用Matrigel聯合移植［7，8］。另外，淋巴瘤常在血管外以腫塊為首發癥狀來就診。鑒于此，本實驗選用腹腔內成瘤。我們將7.5×106個Namalwa細胞經SCID小鼠腹腔接種后 （18.67±1.94）d，在腹腔出現包塊，經病理觀察及免疫組化檢測B細胞淋巴瘤特征性抗原的結果提示，接種Namalwa細胞在SCID小鼠腹腔可以成功建立人B細胞淋巴瘤模型。在我們的實驗中，雌、雄各有一只SCID小鼠未成瘤，可能與SCID小鼠存在Leaky現象（即：滲漏，在小鼠體內檢測到淋巴樣細胞和免疫球蛋白）有關［9］。

圖4 免疫組化檢測淋巴瘤組織中的特征性標記物

閆金松等將5×106及10×l06個Daudi細胞經SCID小鼠尾靜脈移植建立淋巴瘤模型，觀察到2周時出現豎毛、精神萎靡等變化，出現雙下肢癱瘓的中位時間是30.5d（29－32d），存活時間是40d，而兩個細胞濃度的發病時間、發病情況沒有區別［5］。我們通過腹腔接種Namalwa細胞株后（5－7d）觀察到豎毛，而腹腔出現包塊的時間是（18.67±1.94）d，存活時間為（28.00±6.36）d。上述結果的不一致可能與接種瘤細胞的途徑及細胞株類型不同有關。

我們觀察到接種Namalwa細胞后，荷瘤鼠的瘤體生長速度快，且累及多個臟器及組織，在肝、脾、胰、腎、肺、胃、腸、盆腔臟器、鄰近的肌肉和皮膚等有瘤細胞的廣泛浸潤。Namalwa細胞株來自B細胞淋巴瘤患者。用免疫組化的方法檢測到瘤組織表達B細胞特征性標記物CD79a為強陽性，CD20為散在分布（與CD79a抗原表達譜較CD20廣有關），而T細胞標記物CD3為陰性。Ki－67是 一種與細胞周期相關的蛋白質，為細胞增殖及DNA合成所必需，是反映細胞增生活性的指標。Ki－67在瘤組織中為彌漫陽性，提示腫瘤細胞增生活躍［10，11］。我們的結果表明在SCID小鼠腹腔成功建立了Namalwa細胞源的人B細胞淋巴瘤模型，這為我們開展后續研究提供載體。

致謝：感謝本院病理科陳天星主任醫師、楊慧主管技師、李英技師、楊宣濤副主任醫師、張會華主管技師的支持和幫助！

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［3］黃諾凡，梁曉華，周鑫莉，等.重組人血管內皮抑素抑制Namalwa淋巴瘤裸鼠移植瘤生長的實驗研究［J］.腫瘤，2009，29（8）：736.

［4］Bertolini F，Fusetti L，Mancuso P，et al.Endostatin，an antiangiogenic drug，induces tumor stabilization after chemotherapy or anti－CD20therapy in a NOD／SCID mouse model of human highgrade non－Hodgkin lymphoma［J］.Blood，2000，96（1）：282.

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