BARF1基因對鼻咽癌細胞NF-κB信號通路及bcl-2基因表達的影響

徐美琴，李友瓊，張雪怡，褚福營，張宇瓊，陳巧林，成靜，周天戟

(1.江蘇大學基礎醫學與醫學技術學院，江蘇鎮江212013;2.廣西壯族自治區人民醫院檢驗科，廣西南寧530022)

EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)屬于皰疹病毒科γ皰疹病毒亞科，1964年首次從非洲兒童的Burkitt淋巴瘤細胞中發現。研究表明，EB病毒是一種致瘤性病毒，與多種惡性腫瘤密切相關，如Burkitt淋巴瘤、免疫缺陷患者的機會性淋巴瘤、Hodgkin淋巴瘤、胃癌、鼻咽癌等［1-2］。其中鼻咽癌是一種惡性度極高的人類腫瘤，EB病毒感染率達100%，EB病毒在其發生中起重要作用［2-3］。BARF1是EB病毒編碼的癌基因，在大多數鼻咽癌組織中都能檢測到［1，3］，但其所起作用及機制尚不清楚。研究發現，BARF1能夠抑制上皮細胞的凋亡［4-6］，而細胞凋亡紊亂與腫瘤的發生發展具有非常密切的關系。核轉錄因子-κB(NF-κB)信號通路在細胞凋亡調控中扮演重要角色［7-10］，而bcl-2是 NF-κB的重要靶基因，是細胞凋亡過程中的重要調節基因之一。本研究旨在探討BARF1對鼻咽癌細胞NF-κB信號通路活性及bcl-2基因表達的影響，以闡明BARF1抑制上皮細胞凋亡的機制。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

人鼻咽癌CEN1細胞系購自中科院上海細胞庫。pSG5-BARF1以及 pSG5空載體穩定轉染的CNE1細胞克隆CEN1-BARF1和CEN1-SG各3個，由本室構建與保存，經RT-PCR鑒定，BARF1表達正常。DMEM(Gibco公司)，胎牛血清(杭州四季青生物技術有限公司)，FITC標記的羊抗兔IgG、抗熒光淬滅封片劑(武漢博士德生物有限公司)，RIPA裂解液、ECL 試劑、DAPI染液、兔抗 NF-κB p65 、bcl-2和β-肌動蛋白抗體、HRP標記山羊抗兔IgG、NF-κB的特異性抑制劑Bay11-7082(碧云天生物技術研究所)，濕式電泳轉移系統、Quantity One圖像分析軟件(Bio-Rad公司)，PVDF膜(Millipore公司)，化學發光成像儀(Sagecreation公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 CNE1-SG和 CEN1-BARF1細胞用含10% 滅活胎牛血清的DMEM，培養于37℃、5%CO2培養箱中。待細胞長滿后，用含0.1%胰蛋白酶和2 mmol/L EDTA的PBS進行消化傳代，取對數生長期細胞進行實驗。

1.2.2 熒光抗體染色法檢測NF-κB p65核轉位將對數生長期的細胞接種于蓋玻片，置于6孔細胞培養板內，培養至密度為70%左右。抑制試驗則換加含25 μmol/L的 Bay11-7082或DMSO繼續培養12 h。以PBS洗2遍，用4%低聚甲醛室溫固定1 h后，PBS洗 3遍，每次 10 min。用 0.25%TritonX-100處理10 min以增加細胞膜通透性，加5%BSA室溫孵育1 h以封閉非特異性結合位點。加兔抗ΝF-κB p65(1∶200稀釋)抗體4℃孵育過夜，次日PBS洗3遍，每次10 min，加FITC標記的羊抗兔IgG(1∶200稀釋)，室溫孵育40 min，PBS洗3遍，每次10 min，DAPI復染10 min，PBS 洗3 遍，每次10 min，以封片劑封片后于熒光顯微鏡下觀察記錄結果。

1.2.3 蛋白質印跡法檢測bcl-2蛋白的表達 細胞培養至密度為70%左右，抑制試驗則換加含25 μmol/L的Bay11-7082或DMSO繼續培養12 h。以PBS洗2遍，用RIPA裂解液提取細胞總蛋白，以BCA試劑盒測定蛋白濃度，按說明書進行操作。按每孔30 μg總蛋白上樣進行SDS-PAGE凝膠電泳，凝膠濃度為12%，采用濕式電泳轉移系統轉移至0.45 μm孔徑的PVDF膜，以含5%脫脂奶粉的TBS室溫封閉1 h，加兔抗bcl-2抗體(1∶1 000稀釋)4℃孵育過夜，次日以TBS-T洗3遍，每次10 min后，加HRP標記的羊抗兔IgG(1∶5 000稀釋)室溫孵育2 h，TBS-T洗3遍，每次10 min，加ECL試劑，在化學發光成像儀下記錄影像。PVDF膜洗去Bcl-2抗體及二抗后，重新與β-肌動蛋白抗體(1∶1 000稀釋)及二抗反應。以Quantity One軟件分析蛋白條帶密度，經β-肌動蛋白校正上樣量后進行統計分析。

1.2.4 統計分析 采用SPSS 11.5軟件包進行統計分析。實驗數據以均數±標準差表示，組間均數的比較采用 t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CNE1-BARF1 中 NF-κB p65 的核轉位現象

熒光抗體染色結果顯示，NF-κB p65呈綠色熒光，而細胞核呈藍色。CNE1-SG中p65主要分布于胞質區域，而胞核區較少;CEN1-BARF1中p65主要分布于細胞核區域，而胞質區較少。經Bay11-7082處理后，細胞核區p65減少，而胞質區增加。見圖1。

圖1 熒光抗體染色法分析CNE1-BARF1細胞中NF-κB p65 的核轉位Fig 1 The nuclear translocation of NF-κB was analyzed by fluorescence antibody staining in CEN1-BARF1

2.2 CNE1-BARF1中Bcl-2蛋白的表達

蛋白質印跡結果顯示，CNE1-BARF1中Bcl-2蛋白的表達量顯著高于 CNE1-SG(t=3.89，P＜0.05)，經Bay11-7082 處理后則顯著下降(t=3.13，P ＜0.05)。見圖2。

圖2 蛋白質印跡法分析CNE1-BARF1細胞中Bcl-2蛋白的表達Fig 2 Bcl-2 protein expression was analyzed by Western blot in CEN-BARF1

3 討論

BARF1基因存在于EB病毒基因組的BamH IA片段內，編碼相對分子質量為(31～33)×103的分泌型蛋白［11］。多種細胞上的研究表明，BARF1具有很強的促有絲分裂原活性，能抑制細胞凋亡、促進細胞增殖和誘導惡性轉化，具有明顯的致癌活性［4，5，12-13］，但其機制尚不清楚。

細胞凋亡是多細胞生物體內的一種重要的自穩機制，在精確調控特定細胞的數量及清除具有潛在危險性的細胞等方面發揮重要作用。細胞凋亡的異常與多種人類疾病密切相關，在腫瘤的發生發展中起重要作用。多種外界因素可以影響細胞凋亡的過程，它們通過一定的信號轉導途徑將胞外刺激信號轉換成細胞應答反應，從而實現對細胞凋亡的調控，ΝF-κB信號通路即是其中最為常見的一條。

NF-κB 家族主要包括 NF-κB1(p50/p105)，NF-κB2(p52/p100)，RelA(p65)，RelB，c-Rel等 5 個成員，其亞基間可以通過相互作用形成同源或異源二聚體，p50-p65是其中最為常見的形式。細胞在靜息狀態下，NF-κB與其抑制蛋白IκB結合組成異源多聚體，以無活性的狀態存在于細胞質中。當細胞受到NF-κB激活劑刺激時，IκB被磷酸化引起構象改變從而與NF-κB解離，釋放出NF-κB，游離的NF-κB從細胞質易位至細胞核內，發揮轉錄因子活性，從而調節其下游靶基因的表達，引起細胞狀態的改變。NF-κB是細胞凋亡調節過程中起關鍵作用的轉錄因子，因而與許多腫瘤的發生密切相關。研究表明，許多腫瘤組織中存在 NF-κB的異常活化［9-10］。受NF-κB通路調控的下游靶基因有很多，其中包括一些具有凋亡調節作用的基因，bcl-2是其中最為重要的成員之一［14-15］。許多腫瘤組織中存在bcl-2的過表達，其中不少緣于NF-κB通路的異常激活［15］。

多種致癌因子可以引起NF-κB通路的活化。已有研究表明，BARF1可以通過上調bcl-2基因表達抑制上皮細胞的凋亡［6，16］，但其機制尚不清楚。本研究結果顯示，CNE1細胞中表達BARF1后引起了明顯的NF-κB核轉位和bcl-2基因表達增加，且采用NF-κB的特異性抑制劑Bay11-7082處理后，bcl-2表達明顯下降，表明BARF1基因激活了CNE1細胞的NF-κB信號通路，引起了其下游靶基因bcl-2的表達增加，進而抑制了其凋亡進程。

細胞凋亡相關的信號通路調節是一個非常復雜的過程，BARF1通過哪些上游途徑活化了NF-κB，以及是否還通過其他途徑介導了BARF1對bcl-2表達的上調等問題尚待進一步研究。

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