非小細胞肺癌患者外周血上皮細胞黏附分子和黏蛋白的診斷價值

朱文芳，李堅，唐興萍

(江蘇大學附屬醫院1.腎內科，2.呼吸內科，江蘇 鎮江212001)

轉移是惡性腫瘤的標志和特征，也是其治療失敗的主要原因。癌細胞主要通過循環系統和淋巴管播散［1]。其可從原發部位進入血液，在血循環中存活并播散，之后循環腫瘤細胞(CTC)可定位到其他器官部位，在多種細胞因子作用下，與靶器官的組織發生細胞間的相互作用，進而生長形成轉移灶。已有研究報道，在惡性腫瘤患者的外周血中可檢測出CTC，其與患者的預后密切相關。為了探討作為CTC 分子標志物的上皮細胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)mRNA 和黏蛋白1(MUC1)mRNA 檢測對非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)診斷與病情評估的臨床價值，我們前瞻性研究了實時熒光定量-PCR(qRTPCR)技術檢測NSCLC 患者外周血EpCAM mRNA和MUC1 mRNA 表達與臨床病理學的相關性。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選自2011年11月至2012年11月在江蘇大學附屬醫院住院的NSCLC 患者45例，均為未接受過任何抗腫瘤治療的初發就診病例，并除外其他腫瘤肺部轉移。患者均經病理組織學(纖維支氣管鏡活檢、手術切除、經皮肺穿刺針吸活檢、淋巴結穿刺活檢)檢查確診為NSCLC。45例患者中鱗癌27例，腺癌18例;其中，男28例，女17例，年齡42 ～88歲，平均63 歲。依據國際抗癌聯盟(UICC)2002年制定的TNM 分期標準，Ⅰ+Ⅱ期18例，Ⅲ+Ⅳ期27例。

另選擇同期住院21例肺部良性疾病患者作為對照組，分別為肺炎9例，慢性阻塞性肺疾病6例，支氣管哮喘2例，間質性肺病2例，硅肺病1例，結核性胸膜炎1例。為評測實驗結果的穩定性，同時選取健康志愿者14例血標本作為對照(樣本mRNA 校對值)。

1.2 方法

1.2. 1 主要試劑和儀器 Trizol 試劑購自美國Invitrogen公司，反轉錄試劑盒購自美國Fermentas 公司，熒光定量試劑盒購自日本Toyobo 公司，熒光定量PCR 儀CFX96 購自美國Bio-Rad 公司。

1.2.2 樣本采集 所有入選患者均空腹抽取外周靜脈血4 mL，置于EDTA 抗凝管，用淋巴細胞分離液分離有核細胞。按Trizol 試劑盒操作說明溶解細胞，提取總RNA，于紫外分光光度計定量后，嚴格按反轉錄試劑盒說明進行反轉錄反應。

1.2.3 引物設計 參考EpCAM基因和MUC1 基因序列設計引物，另設計管家基因β-肌動蛋白作為內參照，所有引物均由上海生工生物工程有限公司合成。見表1。

表1 引物序列Tab 1 Oligonucleotide sequences of primers

1.2.4 qRT-PCR 每份血標本均擴增β-肌動蛋白、EpCAM 以及MUC1。按每個反應終體積20 μL，其中反轉錄混合物2 μL，DEPC 處理水7 μL，上下游引物各0.5 μL，PCR 混合液10 μL。梯度實驗提示2種基因的退火溫度接近，故PCR 條件均為95 ℃預變性30 s，按下述步驟循環，95 ℃5 s;59 ℃30 s;72 ℃30 s延伸，共40 個循環。

1.2.5 結果分析 根據上述方法檢測EpCAM mRNA 和MUC1 mRNA 的表達，所得的CT 值采用2-ΔΔCT方法計算出靶基因mRNA 相對表達量，構建ROC 曲線，找出確定EpCAM mRNA 和MUC1 mRNA敏感性和特異性的折點(上限值)，分別為3.02 和1.52，高于該上限值為陽性。

1.3 統計學分析

采用SPSS 16.0 統計軟件進行數據處理。鑒于測得的EpCAM mRNA 和MUC1 mRNA 表達量為非正態分布，兩組間的比較采用Mann-WhitneyU檢驗。EpCAMmRNA 和MUC1mRNA 表達水平之間的相關性采用Spearman 相關系數分析。兩組間的陽性率比較采用χ2檢驗或Fisher精確檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 外周血中EpCAM mRNA 和MUC1 mRNA 的表達

NSCLC 患者外周血中EpCAM mRNA 和MUC1 mRNA 的表達水平均明顯高于肺部良性疾病患者(P=0.025和P=0.018)。NSCLC 患者和肺部良性疾病患者的EpCAM mRNA 與MUC1 mRNA 的表達水平之間均無明顯相關性(NSCLC 患者，r=0.135，P＞0.05;肺部良性疾病者，r=0.118，P＞0.05)。以3.02 和1.52分別作為EpCAM mRNA 和MUC1 mRNA 表達水平的上限時，NSCLC 患者外周血中EpCAM mRNA 和MUC1 mRNA 的陽性表達率分別為48.9%和53.3%;肺部良性疾病患者陽性表達率分別為4.7%和0.0%。兩組間比較差異有統計學意義(P均=0.001)。見表2。

表2 兩組患者外周血中上皮細胞黏附分子和黏蛋白1 表達的比較Tab 2 Comparison of mRNA expressions of epithelial cell adhesion molecule (EpCAM)and mucin1 in peripheral blood between two groups

2.2 外周血中EpCAM mRNA 和MUC1 mRNA 檢測的敏感性和特異性

分別取3.02 和1.52 為EpCAM mRNA 和MUC1 mRNA 表達量的上限，檢測其診斷NSCLC 的敏感性、特異性、陽性預測值和陰性預測值。結果表明，兩者對NSCLC 外周血微轉移均有一定的診斷價值。見表3。

表3 外周血中上皮細胞黏附分子和黏蛋白1 對NSCLC 的診斷價值 %(n/n)Tab 3 Diagnostic value of mRNA expressions of epithelial cell adhesion molecule(EpCAM)and mucin1 in peripheral blood from patients with non-small cell lung cancer

2.3 外周血中EpCAM mRNA 和MUC1 mRNA 表達陽性率與臨床病理特征之間的相關性

結果顯示(表4)，NSCLC 患者外周血中EpCAM mRNA 和MUC1 mRNA 的表達陽性率與其年齡、性別、腫瘤病理類型無明顯相關性;與臨床TNM 分期顯著相關，Ⅲ+Ⅳ期患者外周血中EpCAM 和MUC1 mRNA 表達陽性率明顯高于Ⅰ+Ⅱ期患者(EpCAM mRNA，P=0.021;MUC1 mRNA，P=0.005)。

表4 NSCLC 患者外周血中上皮細胞黏附分子和黏蛋白1 表達與臨床特征的相關性Tab 4 Correlations between epithelial cell adhesion molecule (EpCAM)and mucin1 and clinical characteristics in peripheral blood from patients with non-small cell lung cancer

3 討論

NSCLC 患者的高病死率與癌細胞發生隱匿性微轉移有關。在病程的早期，癌細胞就可播散到原發灶的遠處部位，而傳統的診斷學方法并不能檢測到這種轉移的隱匿性單個癌細胞或癌細胞集落。癌細胞只有以存活狀態經血液循環黏附于小血管或毛細血管，才有可能發生血行轉移。由于RNA 極易被降解，故在NSCLC 患者外周血中檢測到腫瘤特異性基因的表達，就提示循環系統中有存活狀態的腫瘤細胞，也就預示著腫瘤具有較高的轉移傾向。目前尚未發現某個腫瘤特異性基因能在所有NSCLC 中表達。為此，國內外學者應用反轉錄PCR 及相關技術，尋找NSCLC 特異性基因的表達并探討其臨床意義，發現某些基因的高表達與NSCLC 患者的預后存在密切關系［2-3]。

EpCAM 又稱為腫瘤相關鈣信號轉導蛋白1(TACSTD1)，是由TACSTD1 基因編碼的Ⅰ型跨膜蛋白。EpCAM 幾乎表達于所有上皮組織，在上皮來源的腫瘤細胞中呈高表達，但在肝細胞、結締組織、造血系統來源的細胞、腦組織和血管內皮細胞中不表達或低表達［4]。它通過參與細胞的黏附、遷移、增殖、分化等從而促成腫瘤的發生及轉移。Yanamoto等［5]研究顯示，EpCAM 高表達的腫瘤細胞增殖活性高，侵襲性強，下調其表達可顯著抑制腫瘤細胞的增殖活性及侵襲性。Gastl 等［6]在研究乳腺癌組織中EpCAM 表達與患者生存率之間的關系時發現，36%乳腺癌腫瘤組織中EpCAM 呈高表達，且該高表達與患者腫瘤分期和組織學類型相關，而與激素受體狀態、年齡、腫瘤大小和淋巴結陽性無明顯相關性。Karanikiotis 等［7]應用RT-PCR 技術檢測EpCAM 在結直腸癌患者的外周血和骨髓中的表達，結果顯示，26 份外周血(96%)和19 份骨髓樣本(73%)中有EpCAM 表達，表明EpCAM 在結直腸癌患者的外周血中呈高表達。雖然在眾多惡性腫瘤中發現Ep-CAM 呈高表達，但尚未能確定其表達程度與患者臨床轉歸之間的關系。

黏蛋白(MUC)是廣泛分布于正常機體各種黏膜表面的高分子量蛋白，其中MUC1 是一種Ⅰ型跨膜蛋白，它可降低腫瘤細胞間的黏附力，從而增強腫瘤細胞與血管內皮細胞的黏附，使其易于穿過血管壁，進而促進腫瘤細胞的轉移［8]。MUC1 對腫瘤細胞的黏附作用具有雙向調節功能。MUC1 在正常肺、支氣管組織和NSCLC 患者的癌組織中均有表達，但在正常人體外周血中無表達或低表達。因此，如果在NSCLC 患者外周血中檢測到MUC1 mRNA呈較高表達，則提示有循環腫瘤細胞存在。蔡祖勛等［9]研究顯示，NSCLC 組織中MUCI mRNA 的陽性表達率與患者的預后呈負相關。根據MUC1 的生物學功能及其與腫瘤的關系，鄭順利等［10]指出，檢測外周血中MUCI mRNA 的表達水平是一項衡量肺癌患者有無癌轉移的有價值的指標，可為臨床醫師制訂治療方案和評估患者預后提供重要的參考依據。

本研究采用qRT-PCR 技術檢測外周血中mRNA 的表達，結果顯示，NSCLC 患者EpCAM mRNA和MUC1 mRNA 表達水平及其陽性表達率均明顯高于肺部良性疾病患者。檢測外周血中EpCAM mRNA 和MUC1 mRNA 診斷NSCLC，特異性(95.3%和100.0%)和陽性預測值(95.6%和100.0%)均較敏感性(48.9%和53.3%)高。NSCLC 患者外周血中EpCAM mRNA 或MUC1 mRNA 呈高表達，提示有存活的癌細胞存在，具有較高的轉移傾向。因此，檢測兩者mRNA 表達對NSCLC 患者外周血微轉移的診斷有一定的臨床價值。本研究在對NSCLC 患者臨床病理學特征與外周血EpCAM mRNA 和MUC1 mRNA 陽性表達率的相關性進行分析時發現，兩者陽性表達率與患者年齡、性別、病理類型無關;與腫瘤TNM 分期顯著相關，隨腫瘤TNM 分期增高，mRNA 陽性表達率明顯增加，提示NSCLC 患者分期越晚，肺癌細胞脫落至血循環的可能性越大。

本研究中，部分患者TNM 分期尚處于早期(Ⅰ-Ⅱ期)，其外周血中EpCAM mRNA 或MUC1 mRNA 呈陽性表達，提示這部分經手術根治性切除的患者可能已有血源性微轉移存在。事實上，臨床上確實有一些經手術根治性切除的Ⅰ-Ⅱ期NSCLC患者在術后5年內出現轉移復發，說明通過常規影像學檢查確定的部分早期(Ⅰ-Ⅱ期)NSCLC 患者已經不是真正意義上的早期。因此，根據血液中Ep-CAM mRNA 或MUC1 mRNA 等腫瘤特異性基因表達的檢測結果再重新分期，進而調整或改變治療策略，對于臨床已行TNM 分期的NSCLC 患者而言，具有重要的臨床意義。例如，對于早期發現的有微轉移和遠處轉移傾向的高危患者，在腫瘤負荷較低的前提下，增加新輔助化療或及時給予輔助化療，有可能降低遠處轉移的風險［11]。

腫瘤微轉移檢測的臨床價值需要大樣本量的前瞻性隨機對照和長期隨訪研究來論證。由于時間關系，本研究未能評價NSCLC 患者外周血中EpCAM mRNA 和MUC1 mRNA 表達與其預后的相關性(NSCLC 患者仍在隨訪中)。

另外，本研究中1例肺部良性疾病患者EpCAM mRNA 呈陽性表達(陽性率4. 7%)，其原因可能:①血細胞中EpCAM 假基因的擴增;②RNA 提取過程中的DNA 污染;③局部炎癥侵襲小血管，使其通透性升高或破裂，上皮細胞逸入循環等。

綜上所述，我們的研究結果結合文獻報道表明，檢測外周血中EpCAM mRNA 和MUC1 mRNA 的表達，對于診斷NSCLC，尤其診斷腫瘤微轉移可能具有重要的臨床價值。

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