褪黑素受體MT1 和轉錄因子Sp1 在乳腺癌組織中的表達及臨床意義

曾建，陳麗萍，陳淼，陳艷，許豪勤，狄榮科

(1.江蘇大學基礎醫學與醫學技術學院，江蘇 鎮江212013;2.鎮江市人口與計劃生育委員會，江蘇 鎮江212001)

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一，嚴重危害患者生命健康。褪黑素是一種主要由松果體合成并分泌的吲哚類激素，具有抗氧化、抗腫瘤、調節生物節律、參與免疫調節等多種功能［1]。近年來，人們越來越關注褪黑素對乳腺癌的抑制作用。Sanchez-Barcelo 等［2]研究發現，褪黑素可以通過褪黑素受體1(melatonin receptor，MT1)途徑降低細胞內cAMP水平，阻斷雌激素信號轉導通路，抑制雌激素受體(ER)α 陽性乳腺癌細胞的增殖和侵襲。Collins等［3]研究顯示，MCF-7 乳腺癌細胞中MT1 的表達有助于褪黑素的抗腫瘤細胞增殖作用，MT1 表達水平越高，褪黑素的抗腫瘤增殖作用越強。

轉錄因子Sp1(transcription factor Sp1)是一種DNA 結合蛋白，通過調控富含GC/TC 序列的啟動子的表達，參與細胞增殖、分化、凋亡等多種功能的調節［4]。Maor 等［5]指出，ER 通過與轉錄因子Sp1相互作用，調節乳腺癌細胞中胰島素樣生長因子-1受體基因的轉錄和表達，從而促進人乳腺癌MCF-7細胞的增殖。本研究旨在檢測MT1 和Sp1 在乳腺癌組織中的表達及其相關性，探討兩者在乳腺癌的發生發展過程中可能的作用機制，為乳腺癌惡性程度的判斷和預后評估提供一定的依據。

1 材料與方法

1.1 標本和資料來源

收集2011年1月至2012年6月在鎮江市第一人民醫院行乳腺癌根治手術的90例乳腺癌標本，50例癌旁正常乳腺組織(距癌組織5 cm 以上)，每例標本于手術取材后立即凍存于液氮中。樣本均取自女性患者，年齡33 ～84 歲，平均53.6 歲，所有患者術前均未接受放、化療及其他治療。制備的病理切片均經兩位以上副高職稱的臨床病理醫師診斷確認。其中，乳腺浸潤性導管癌68例，乳腺導管內癌22例;局部腋窩淋巴結轉移41例，無轉移49例。按照2003年WHO 分類標準對浸潤性導管癌(根據腺腔形成、核的多形性、每10 個高倍視野的核分裂相計數)進行診斷和分級，其中Ⅰ級17例，Ⅱ級32例，Ⅲ級41例。

1.2 主要試劑

兔抗人MT1 多隆抗體(bs-0027R)購自北京博奧森生物技術有限公司，工作液濃度為1 ∶100;兔抗人Sp1 多克隆抗體(No. SC-59 )和β-肌動蛋白購自美國Santa Cruz 公司，工作液濃度為1 ∶150。蛋白預染標準參照物購自美國Fermenta 公司，SP免疫組織化學試劑盒購自福州邁新試劑公司，RIPA 組織裂解液、DAB 顯色劑購自武漢博士徳公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫組織化學SP 法 所有標本進行常規固定、脫水、透明、石蠟包埋，然后3 μm 連續切片、脫蠟、水化，PBS 洗滌。采用高溫熱修復法修復抗原;分別滴加50 μL 一抗，陰性對照用PBS 代替一抗，4℃濕盒孵育過夜;PBS 洗滌;分別滴加50 μL HRP標記的二抗，室溫下孵育30 min;PBS 充分洗滌;DAB 顯色5 ～10 min，流水沖洗;蘇木素復染、藍化、脫水、透明、封片，在顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.2 蛋白質印跡 取液氮中保存的乳腺癌組織(癌組織占所取總組織的80%以上)和癌旁正常乳腺組織，用RIPA 組織裂解液提取細胞總蛋白，蛋白定量后分裝樣品，于-80 ℃保存。每例標本取總蛋白20 μg，加5 μL 蛋白預染標準參照物作為標準參照，經10%SDS-PAGE 電泳分離后電轉移至PVDF膜，觀察預染標準參照物的轉移效果，判斷樣品的轉移效果，ECL 化學發光試劑檢測雜交信號，UPV 掃描儀掃描成像。

1.4 結果判斷

MT1 蛋白主要定位于細胞質或細胞膜，Sp1 蛋白主要定位于細胞核，出現黃色或棕黃色顆粒為陽性。在光鏡下觀察，按陽性細胞所占比例及分布情況記錄如下:陰性(-)，即所有細胞中均沒有染色;弱陽性(+)，即局灶性陽性著色細胞數＜10%;中度陽性(++)，即陽性著色細胞數為10% ～50%;強陽性(+++)，即陽性著色細胞數≥50%。

1.5 統計學分析

應用SPSS 16.0 軟件對數據結果進行χ2檢驗和方差分析以及Pearson 相關性檢驗，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MT1、Sp1 在乳腺癌組織及癌旁正常乳腺組織中的表達

蛋白質印跡結果顯示，乳腺癌組織、癌旁正常乳腺組織均表達MT1、Sp1 蛋白，且乳腺癌中MT1、Sp1蛋白的表達均高于其在癌旁正常乳腺組織中的表達(圖1)，每組實驗均重復3 次，與免疫組織化學結果一致(圖2)。

圖1 蛋白質印跡法檢測MT1 和Sp1 在不同乳腺組織中的表達Fig 1 Western blotting results of MT1 and Sp1 expressions indifferent breast tissues

MT1 在乳腺癌組織和癌旁正常乳腺組織中的陽性表達率分別為64. 4% (58/90)，22. 0% (11/50)，兩者比較差異有統計學意義(P＜0.01)。Sp1在乳腺癌組織和癌旁正常乳腺組織中的陽性表達率分別為74.4%(67/90)，28.0%(14/50)，兩者比較差異有統計學意義(P＜0.01)。見表1。

2.2 MT1、Sp1 的表達水平與乳腺癌臨床病理特征的關系

乳腺癌組織中MT1、Sp1 的表達與患者年齡、腫瘤大小及組織學分級無明顯相關性(P＞0.05)，而與腫瘤浸潤、淋巴結轉移及TNM 分期有關(P＜0.05)，見表2。

圖2 免疫組織化學法檢測MT1 和Sp1 在不同乳腺組織中的表達(SP×200)Fig 2 Immunohistochemistry analysis of the expressions of MT1 and Sp1 in breast tissues

表1 乳腺癌組織及癌旁正常乳腺組織中MT1 和Sp1 的表達Tab 1 The expressions of MT1 and Sp1 in breast cancer tissues and adjacent normal breast tissues

表2 MT1、Sp1 的表達與乳腺癌臨床病理特征的關系Tab 2 The relationship between expressions of MT1 and Sp1 and clinicopathologic characteristics of breast cancer

2.3 乳腺癌組織中MT1、Sp1 表達的相關性

經Spearman 相關性分析，乳腺癌組織中MT1與Sp1 的表達呈正相關(r=0.523，P＜0.01)。見表3。

表3 乳腺癌組織中MT1 與Sp1 表達的相關性Tab 3 The correlation of MT1 and Sp1 expressions in breast cancer tissues

3 討論

褪黑素受體為G 蛋白偶聯受體，在人體內主要有MT1 和MT2 亞型，其功能尚不完全明確。MT2主要調節晝夜節律、血管舒張、機體免疫等功能，MT1 主要調節生殖、代謝、血管收縮、腫瘤細胞增殖等功能［6]。本研究結果顯示，MT1 在癌旁正常乳腺組織中低表達(22. 0%)，在乳腺癌組織中高表達(74.4%)，兩者比較差異有統計學意義(P＜0.01)。MT1 在乳腺癌組織中，大多呈強陽性表達，而在癌旁正常乳腺組織中，表達全部呈陰性或弱陽性。該現象表明，MT1 編碼基因在乳腺癌的發生過程中可能被激活，從而呈高表達。本研究還顯示，MT1 在乳腺癌組織中的表達與腫瘤大小、患者年齡、組織學分級無明顯相關性(P＞0.05)，而與腫瘤浸潤、淋巴結轉移及TNM 分期呈正相關(P＜0.05)，可見乳腺癌生物性越活躍，MT1 表達程度越強，這可能與MT1 調節惡性腫瘤增殖有關［7]。Dillon 等［8]研究MT1 在乳腺癌中的表達時發現，腫瘤惡性程度越高，MT1 表達水平越高，這與本實驗結果一致。Yuan 等［9]研究發現，乳腺癌細胞中MT1 受體表達水平越高，腫瘤細胞對褪黑素敏感性越強。本研究結果顯示，乳腺癌組織中MT1 的表達水平明顯高于癌旁正常乳腺組織，且與腫瘤的復發或轉移相關。這提示MT1 可作為乳腺癌術后風險判斷指標之一，推測如果檢測到乳腺癌患者腫瘤細胞中MT1 呈高表達，則提示復發或轉移的風險較大，預后可能較差。同時MT1 在乳腺癌細胞中的高表達，為外源性褪黑素與乳腺癌結合提供了可供利用的靶點，為進一步研究外源性褪黑素在治療乳腺癌中的應用提供了依據。Mao 等［10]研究也發現，褪黑素通過受體MT1 抑制乳腺癌細胞的侵襲，可能是通過特異性下調p38MAPK 通路，抑制MMP-2 和MMP-9 的表達及活化而實現的。正常人體內褪黑素的分泌水平隨著年齡的增長逐漸下降［11]，MT1 的表達與褪黑素的分泌水平呈負相關，褪黑素分泌越少，MT1 表達越多［8]。此外，Karasek 等［12]研究發現，惡性腫瘤患者血清中的褪黑素水平較低。本研究中乳腺癌組織中MT1 異常高表達的原因可能是乳腺癌患者血清中褪黑素水平極低，無法與MT1 全部結合內化，從而導致MT1 異常堆積于乳腺癌細胞膜上。

Sp1 是具有鋅指結構的一種核受體家族轉錄因子，含有A、B、C、D 4 個結構域，廣泛存在于幾乎所有組織的細胞核中［13]。轉錄因子Sp1 通過多種途徑，如翻譯后修飾、與其他蛋白結合等，影響其轉錄活性［14]。同時，Sp1 的激活與高表達促進腫瘤細胞的生長、分化和轉移，可能是通過上調腫瘤轉化生長因子及血管生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)等基因的表達，改善了腫瘤周圍局部微環境的結果［15]。Maor 等［5]研究結果顯示，Sp1 通過與ERα 相互作用，調節乳腺腫瘤細胞中胰島素樣生長因子-1 受體基因的轉錄和表達，從而促進人乳腺癌MCF-7 細胞的增殖。此外，Sp1 也在其他多種腫瘤組織中高表達。Jia 等［16]研究發現，Sp1 在人胰腺癌細胞中異常活化，上調了腫瘤細胞中VEGF 的表達，從而促進了腫瘤的侵襲和遠處轉移。Wang等［17]研究表明，胃癌組織中Sp1 的高表達與其發生發展密切相關，是胃癌患者預后不良的因素之一。本研究結果顯示，乳腺癌組織中Sp1 的陽性表達率明顯高于癌旁正常乳腺組織，說明Sp1 的異常表達可能在乳腺癌的發生發展中起一定促進作用。此外，Sp1 在TNM 分期Ⅲ-Ⅳ期患者中的陽性表達率高于TNM 分期Ⅰ-Ⅱ期患者(P＜0.05)，在伴有癌組織浸潤和淋巴結轉移患者中的陽性表達率分別高于無癌組織浸潤和無淋巴結轉移者(P＜0.01)，與王曉冰等［18]研究結果一致，提示Sp1 的異常表達可作為判斷乳腺癌發生、侵襲和轉移進程的一項分子指標。

本研究顯示，乳腺癌組織中MT1 的表達與Sp1的表達呈正相關(r=0.523，P＜0.01)，表明兩者在乳腺癌組織中的表達趨勢相一致，提示其可能共同參與了乳腺癌的發生發展、侵襲和轉移。在乳腺癌患者中，高表達的Sp1 促進乳腺癌的發生發展，而血清中低水平的褪黑素不能通過結合MT1 發揮抗腫瘤作用，于是MT1 代償性異常高表達。在正常人體內，可能由于褪黑素與MT1 的結合激活了PKA 信號通路，通過抑制MMP-2 的表達影響了Sp1 的轉錄活性，從而抑制腫瘤的發生。其具體機制尚待進一步研究。

綜上所述，MT1、Sp1 的異常表達可能在乳腺癌的發生發展、浸潤和淋巴結轉移中發揮著重要作用;檢測兩者在乳腺癌組織中的表達情況，可為探索乳腺癌相關的發病機制及基因靶向治療提供一定的依據。

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