辛伐他汀對LPS誘導BV2小膠質細胞極化狀態的影響

吳 非 羅 濤 郭遠瑾 梅元武

小膠質細胞是中樞神經最重要的固有免疫細胞和主要的效應細胞，它在AD、帕金森病、多發性硬化的免疫反應中既能分泌神經毒性因子又能分泌神經營養因子，表現出促炎及抗炎的雙重作用，表現為M1型和M2型兩種極化狀態［1～3］。因此，干預小膠質細胞的極化狀態對于調整神經系統免疫應答進而干預疾病病程極具研究意義的。近年來，通過深入研究證實他汀類藥物除了降脂作用外，還有重要的抗炎和免疫調節作用，能夠抑制多種炎性因子的表達，已經在如多發性硬化等免疫性疾病中用以臨床研究［4］，但究其抗炎機制仍未有確定結論。本實驗通過辛伐他汀干預脂多糖（LPS）誘導的BV2小膠質細胞，檢測小膠質細胞M1和M2型兩種極化狀態分泌因子及相關分子標志的變化，研究辛代他汀對于小膠質細胞不同表型的影響，為進一步闡明辛伐他汀的免疫調節機制提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

BV2細胞購自中國科學院基礎醫學細胞中心，無菌PBS、DMEM 培養基、胎牛血清等細胞培養所需主要試劑均為HyClone公司，LPS購自Sigma公司，Real－time PCR（實時熒光定量）相關試劑盒購買于大連TaKaRa公司，小鼠TNF－αELISA 試劑盒為欣博盛科技有限公司產品。小鼠IL－10、IL－12ELISA 檢測試劑盒、FITC 標記抗小鼠CD206抗體購自Biolegend公司。

1.2 引物 由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，本實驗所用各引物序如下：

基因 引物序列iNOS F：5＇－CTGCAGCACTTGCATCAGGAACCTG－3＇R：5＇－GGAGTAGCCTGTGTGCACCTGGAA－3＇Arg－1 F：5＇－CACCTTGGAGTTCACCCAGT－3＇R：5＇－CGAAGCAAGCCAAGGTTAAAGC－3＇IL－10 F：5＇－TGCTAACCGACTCCTTAATGCA－3＇R：5＇－TCATGGCCTTGAGACACCTTG－3＇GAPDH F：5＇－ACACTCAGACCCCCACCACA－3＇R：5＇－CATAGGCCCCTCCCCTCTT－3＇

1.3 BV2細胞的培養

以小膠質細胞瘤BV2細胞系作為研究對象，將細胞置于DMEM 高糖培養基（含10%胎牛血清，100U／ml青霉素及鏈霉素），以37 ℃、5%CO2培養箱內培養，每隔2～3 d傳代，當細胞貼壁生長且狀態良好后按1×106／ml接種于6孔板。

1.4 BV2細胞實驗分組

BV2細胞分為生理對照組（加DMEM）、LPS處理組（1 ug／ml LPS 孵育24 h）、LPS 及高劑量Simvastatin共孵育 組（1 ug／ml LPS＋20 ug／ml Simvastatin）、LPS及低劑量Simvastatin共孵育組（1 ug／ml LPS＋5 ug／ml Simvastatin）四組。

1.5 ELISA 測定各組TNF－α、IL－12、IL－10水平

收集各組細胞經刺激24h 后培養上清，按ELISA 試劑盒說明書檢測各組TNF－α、IL－12、IL－10水平，顯色后在酶標儀450nm 波長檢測吸光度（D 值），建立標準曲線并計算TNF－α、IL－12、IL－10水平。

1.6 RT－PCR 測 定iNOS、Arg－1、IL－10mRNA 的表達水平

按RNA 提取試劑盒說明書及反轉錄試劑盒說明書操作，分別提取各組細胞總RNA，Nano－Drop1000檢測RNA 的水平，采用TAKARA 逆轉錄及實時熒光定量試劑盒檢測iNOS，Arg－1，IL－10mRNA 的表達，以三磷酸甘油醛脫氫酶（GADPH）作為內參對照。反應參數：95℃變性4 min；95℃30 s，55℃1 min，72 ℃1 min，35 個循環；72 ℃延伸5 min。分別評價的表達，每個樣本設3 個復孔。CT 值代表熒光實時定量PCR 值，ΔCT＝CT（目的基因）－CT（內參基因），ΔΔCT＝ΔCT（實驗組）－ΔCT（對照組）。根據公式可以算出各組細胞中目的基因表達／對照組細胞中目的基因表達＝2－ΔΔCT。

1.7 流式細胞儀檢測BV2 膜蛋白CD206的表達水平

分別將各組BV2細胞棄去培養上清，離心收集細胞于2 mlEP 管中，調整細胞濃度約5×105／管，用PBS洗滌2次，100 ul PBS 重懸，分別加入小鼠FITC－CD206抗體，室溫避光孵育30 min 后，PBS洗3遍，用0.2 ml PBS重懸后，用流式細胞儀FACS Calibur（BD 公司）檢測各組細胞表面CD206表達水平。

1.8 統計學處理

2 結 果

2.1 ELISA 分 析Simvasatin對 于BV2 細 胞 分 泌炎性因子TNF－α、IL－12及抑炎因子IL－10的影響

如圖1所示，LPS組BV2分泌炎性因子TNFα、IL－12含量均較生理對照組顯著增加（P＜0.05），而IL－10表達量較生理對照組無顯著差異（P＞0.01），而辛伐他汀高劑量及低劑量組較LPS 組TNF－α、IL－12含量明顯降低（P＜0.05），而抑炎因子IL－10分泌量較LPS組顯著增加（P＜0.05）。

圖1 各組TNF－α、IL－12、IL－10 表達水平 與生理對照組比較，＊P＜0.05；與LPS組比較，＃P＜0.05

2.2 RT－PCR 分析Simvasatin對于BV2細胞M1／M2 極 化 標 志 性 分 泌 因 子iNOS、Arg－1、IL－10mRNA 變化的影響

如圖2所示，BV2細胞M1型極化的標志分子iNOS在LPS 組均較生理對照組明顯增高（P＜0.05），而辛伐他汀高低劑量組iNOSmRNA 均較LPS組顯著降低，并且替代激活途徑M2型極化的標志分 子Arg－1、IL－10mRNA 均 較LPS 組 顯 著 增高（P＜0.05）。

2.3 流式細胞儀檢測膜蛋白CD206分析Simvasatin對于LPS誘導的M1型BV2細胞向M2型轉化的影響

如圖3 所示，BV2 小膠質細胞絕大部分表達CD206蛋白（陽性率為90%～98%），但各組的表達強度存在顯著差異，生理對照組及LPS 刺激組CD206表達強度較低，其平均熒光強度（Mean）僅分別為29.72和33.49，而給予高低劑量的辛伐他汀后CD206作為M2型極化狀態標志蛋白其表達量明顯增加，熒光強度上升至66.06和70.40，上升幅度為2.1～2.2倍。

圖2 各組TNF－α、IL－12、IL－10 表達水平 與生理對照組比較，＊P＜0.05；與LPS組比較，＃P＜0.05

圖3 各組CD206表達

3 討 論

小膠質細胞作為中樞神經系統主要的免疫效應細胞，在一系列神經系統病理生理過程中發揮著重要作用，其在體內外均有著較強可塑性，在不同條件下可表現為促炎和抑炎促修復的雙重作用［3］。關于其來源，目前認為其與單核細胞是同源的，即腦內單核巨噬細胞系統的細胞［5，6］。研究表明，巨噬細胞亦存在兩種極化途徑，即經典激活M1型及替代激活M2型，M1型巨噬細胞分泌高水平促炎因子如NO、IL－6、IL－12、TNF－α等，其分子標志是CD16／32等；而M2型細胞則分泌IL－10、TGF－β等抑炎因子抑制M1型反應，發揮修復組織及重塑的功能，其標志物是精氨酸酶（Arg－1）及CD206等［7，8］，它們之間的鑒別也主要和通過對這些細胞膜分子及相關細胞因子的檢測來實現。同時，這些分泌因子也體現其功能表現，如Weber等研究發現醋酸格拉替雷可誘導單核細胞高分泌IL－10，而IL－12的產生減少，證實具有M2 表型的單核細胞可通過誘導調節性T細胞減輕EAE 的發病［9］。因此，本研究通過檢測TNF－α、iNOS、IL－12判斷BV2向炎性M1型極化，檢測IL－10、Arg－1、CD206判斷向抑炎M2型極化，共同評價BV2細胞極化狀態受到不同因素的影響。

他汀類藥物作為HMG－CoA 抑制劑是最重要的降指藥物之一，廣泛應用心腦血管疾病中抗動脈粥樣硬化的治療，近年大量研究發現其除降脂作用外還包括抗炎、免疫調節、抗氧化等，因而在治療免疫介導的疾病如多發性硬化、器官移植排斥等方面具有令人囑目的應用前景。本研究發現，BV2細胞受到LPS誘導后其分泌促炎因子如IL－12、TNF－α明顯增加，而給予Simvastatin處理的細胞組促炎因子分泌減少，而抑炎因子IL－10分泌增多，這也證實了其抑制炎癥的免疫調節作用。在對小鼠EAE 動物模型研究中Youssef亦證實了他汀藥物能抑制EAE致病灶的復發及進展，也獲得了與體內試驗相似的結論［10］。然而，關于他汀藥物抑炎機制的研究目前卻無定論，本研究通過對BV2細胞膜標志蛋白CD206的分析，觀察到Simvastatin處理組M2型極化細胞比例升高，M1型細胞比例有所下降，證實了Simvastatin對于小膠質細胞極化狀態具有逆轉調節作用，從而影響其參予的神經疾病免疫反應，發揮其抑炎并促進組織修復作用，這很可能是其發生抑炎作用的重要機制之一。

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2 David S，Kroner A.Repetoire of microglial and macrophage responses after spinal cord injury.Nat Rev Neurosci，2011，12：388－399.

3 Melief J，Koning N，Schuurman KG，et al.phenotyping primary human nicroglia：tight regulation of LPS responsiveness.Glia，2012，60（10）：1506－1517.

4 Shimizu K，Aikawa M，Takayama K，et al.Direct anti－inflammatory mechanisms contribute to attenuation of experimental allograft arteriosclerosis by statins.Circulation，2003，108（17）：2113－2120.

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6 Prinz M，Priller J，Sisodia SS，et al.Ransohoff RM.Heterogeneity of CNS myeloid cells and their roles in neurodegeneration.Nat Neurosci，2011，14（10）：1227－1235.

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9 Weber MS，Prodhomme T，Youssef S，et al.TypeⅡmonocytes modulate T cell－mediated central nervous system autoimmune disease.Nat Med，2007，13：935－943.

10 Youseef S，Stiive O，Patarroyo JC，et al.The HMG－CoA，reductase inhibitor，atorvastation promotes a Th2 bias and reverses bpralysis in central nervous system artoimmune disease.Nature，2002，420（6911）：78－84.