五味子配伍對吳茱萸主成分腸吸收的影響及可能機制研究*

★ 嚴子玲 于洋＊ 何金蓮 候遠鑫 (廣州中醫藥大學中藥學院 廣州510006)

中藥配伍研究是方劑學研究的重點。五味子是中醫臨床的一味常用藥，在大多方劑中作“佐”藥配伍應用，即通過某種途徑，增強方中其他藥物的治療作用，具有規律性。五味子散首載于宋·許叔微《普濟本事方》，又名溏泄散，由五味子二兩，吳茱萸半兩組成［1］，主治腎泄。吳茱萸為蕓香科吳茱萸屬植物吳茱萸(Evodia rutaecarpa(Juss.)Benth.)干燥近成熟的果實［2］，所含化學成分類型較多，其中生物堿類為其主要有效成分［3］。如吳茱萸堿和吳茱萸次堿具有抗菌、抗癌、抗炎、鎮痛、抗血小板聚集、抗血栓形成、體溫調節和保護心臟等藥理作用［4－5］。

五味子與吳茱萸的配伍研究目前少有報道，本文以吳茱萸為模型藥物，以主要活性成分吳茱萸堿、吳茱萸次堿為研究對象，建立適用于吳茱萸生物堿吸收研究的大鼠原位灌注模型，研究吳茱萸生物堿在五味子提取物以及在P－pg抑制劑作用下的吸收差異。從腸吸收動力學角度揭示方劑配伍的科學本質。

1 實驗材料

1.1 儀器

BT01－DG2蠕動泵(天津市協達偉業電子有限公司);Shimadzu LC－20AT高效液相色譜儀;SPDM20A二極陣列管檢測器;恒溫水浴鍋(上海醫療器械五廠);RE－2000旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠);TG1650－WS離心機(上海盧湘儀)。

1.2 藥品及試劑

吳茱萸藥材(廣州和翔制藥有限公司，批號:121001，產地:貴州);吳茱萸堿標準品(中國藥品生物制品檢定所，批號:110802－200606);吳茱萸次堿標準品(中國藥品生物制品檢定所，批號:110801－201006);五味子提取物(實驗室自制，木質素含量);維拉帕米(VP，廣州市齊云生物技術有限公司);酚紅(天津市福晨化學試劑廠);十二烷基硫酸鈉(SDS，天津市福晨化學試劑廠);牛血清白蛋白(BSA，Genbase Bioscience Co.);烏來糖(上海潤捷化學試劑有限公司)。乙腈為色譜純，其余試劑均為分析醇。

1.3 動物

健康SD大鼠，♂，體重(250±30)g，由廣州中醫藥大學實驗動物中心提供［實驗動物衛生許可證號:SCXK(粵)2008－0020］。

2 方法與結果

2.1 吳茱萸提取物的制備

精密稱取吳茱萸藥材100g，用10倍量80%的乙醇加熱回流三次，每次3小時。合并提取液，靜置過濾，減壓濃縮至無醇味，離心取沉淀，真空干燥后備用。

2.2 試液配制

2.2.1 Krebs－ Ringer，s(K － R) 稱取 NaCl 7.8g，KCl 0.35g，CaCl20.37g，NaHCO31.37g，NaH3PO40.32g，MgCl20.02g，葡萄糖1.4g，蒸餾水定容至1L，即得到PH7.4的K－R液。

含BSA的 K－R液:精密稱取 BSA 4g，置于100mL容量瓶中，加K－R液溶解，稀釋定容至刻度，搖勻，得到含4%BSA的K－R液。

酚紅K－R液:精密稱取酚紅20mg，置1 000mL容量瓶中，加K－R液溶解，稀釋定容至刻度，搖勻，得到濃度為20μg/mL的酚紅K－R液。

含BSA的酚紅K－R液:精密稱取BSA 4g，置于100mL容量瓶中，加酚紅K－R液溶解，稀釋定容至刻度，搖勻，得到含4%BSA的酚紅K－R液。

2.2.2 腸循環液 精密稱取吳茱萸醇提物100mg，置于100mL容量瓶中，加入1mLDMSO超聲溶解后，稱取BSA 4g加入其中，然后加入酚紅K－R液，超聲溶解，并室溫稀釋定容到刻度，搖勻，使吳茱萸醇提物的濃度為1mg/mL。

2.2.3 加五味子提取物的腸循環液 分別稱取吳茱萸醇提物100mg于3支100mL容量瓶中，各加入50，100，200mg的五味子提取物，分別加入1mL DMSO超聲溶解后，各稱取BSA 4g加入其中，然后加入酚紅K－R液，超聲溶解，并室溫稀釋定容到刻度，搖勻即得。

2.2.4 加P－gp抑制劑的腸循環液 稱取吳茱萸醇提物100mg于100mL容量瓶中，加1mL DMSO超聲溶解后，稱取4g BSA加入其中，然后加入酚紅K－R液，超聲溶解，再加入維拉帕米(0.1mg·mL－1)，超聲溶解后用酚紅K－R液室溫定容到刻度，搖勻即得。

2.3 腸循環灌流液中藥物濃度的測定

2.3.1 色譜條件 色譜柱:Kromasil C18色譜柱(250mm ×4.6mm);Phenomenex C18預柱;流動相:乙腈 － 水(49∶51);流速:1.0mL/分，檢測波長:吳茱萸堿225nm，吳茱萸次堿 345nm;進樣量:20μL，柱溫:25℃。

2.3.2 對照品溶液的制備 分別精密稱取吳茱萸堿、吳茱萸次堿標準品 2.16，2.62mg，置于 50mL 容量瓶中，加入甲醇超聲溶解，放置室溫后用甲醇定容搖勻，為母液1。取0.5mL母液1置于2mL容量瓶中，加入含BSA的酚紅K－R液0.5mL后，加甲醇至刻度搖勻，然后渦旋1分鐘，沉淀過夜，次日取出6 000r離心20分鐘，取上清即得吳茱萸混合對照品母液。

2.3.3 標準曲線的制備 精密吸取吳茱萸堿、吳茱萸次堿混合對照品母液適量，按數倍稀釋法，用KR溶液∶甲醇(1∶3，V/V)溶液稀釋，得到一系列標準工作液。在上述色譜條件下進樣測定，記錄色譜數據，以濃度(X)為橫坐標，峰面積(Y)為縱坐標，繪制標準曲線。得回歸方程:吳茱萸堿Y=7.9×10－6X －0.0045，r=0.9999，線性范圍為2.1μg/mL ～10.8μg/mL;吳茱萸次堿 Y=1.7 ×10 －5X+0.0491，r=0.9999，線性范圍為 2.6μg/mL ～13.1μg/mL。吳茱萸堿、吳茱萸次堿的平均回收率分別為100.52%、99.38%，RSD 分別為 2.12%、1.98%。以上結果表明，吳茱萸堿和吳茱萸次堿在各自濃度范圍內呈良好線性關系并具較好的回收率。

圖1 HPLC圖譜

2.3.4 樣品的處理 精密吸取腸灌流液0.5mL，加1.5mL甲醇，渦旋混合1分鐘，放置冰箱沉淀過夜，次日6 000r/分鐘離心20分鐘，取上清液過0.45μm微孔濾膜。在上述色譜條件下進行分析。

2.3.5 精密度實驗 精密吸取對照品母液5μL，連續進樣6次，測定吳茱萸兩堿的峰面積值，其RSD為0.18%(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.3.6 穩定性試驗 用空白腸循環液配1mg/mL的吳茱萸醇提物溶液，置37℃水浴鍋中，并于0，2，4，6h測定溶液中的吳茱萸兩堿含量，其RSD值為0.52%(n=7)，顯示吳茱萸醇提物中2種有效成分在空白腸循環液中具有較好的穩定性。

2.4 大鼠原位腸循環實驗

2.4.1 大鼠原位腸循環實驗方法［6］

取實驗前禁食12h(自由飲水)的SD大鼠，腹腔注射烏拉坦0.6mL/100g，麻醉后固定。沿腹中線打開腹腔(約2.5cm)，結扎膽總管，在實驗腸管兩端各切一小口，在上端小口處插入直徑為0.3cm的玻璃管，并用線扎緊。用注射器將37±0.5℃的生理鹽水緩緩注入腸管，洗去腸管內容物至凈。然后在實驗腸管下端小口處插入玻璃管，并用線扎緊。將腸管兩端的玻璃管與蠕動泵的膠管連接，形成回路，開動蠕動泵。以5mL/分流速循環10分鐘后，將流速調節為2.5mL/分，立即自裝有灌注液的錐形瓶中取樣lmL，作為測定零時間藥物濃度和酚紅濃度的樣品，另向錐形瓶中補加酚紅K－R液lmL，其后每隔20分鐘亦按同法取樣并補加酚紅K－R液，循環3小時后，中止實驗。

2.4.2 原位腸灌流實驗法中參數計算［7］

以小腸內剩余藥量的對數(lnX)對取樣時間t作圖，由直線斜率求出吸收速率常數Ka(h－1)∶Ka=(InX0－InX)/t。剩余藥量 X=CV(C為測得的藥物濃度，V為相應時間的循環液體積)。表現滲透系數Papp:藥物透過胃腸道粘膜的表觀滲透系數Papp，單位為 cm/s。A為小腸吸收面積(cm2)。Papp=Ka/A/3600。

2.4.3 灌流液中酚紅濃度的測定

由于腸灌流的過程中不但有水的吸收，還有水的分泌，導致循液的體積發生變化，通過對酚紅濃度的測定來校正水的吸收。用空白腸灌流液加入酚紅配制一系列標準液，取上述不同濃度的酚紅溶液各0.5mL，加入 4.5mL，1.0mol/L 的 NaOH 溶液顯色，于400～800nm波長范圍內進行掃描在558nm處酚紅有最大吸收，因此于558nm處測定酚紅的吸光度。以吸光度A為縱坐標(Y)、酚紅濃度(μg/mL)為橫坐標(X)，繪制標準曲線。得回歸方程:Y=4.4596X －0.0396，r=0.9988，線性范圍為 8.88μg/mL ～31.08μg/mL，RSD 為2.31，平均回收率為100.56%。

2.5 實驗結果

2.5.1 P－gp抑制劑對吳茱萸總生物堿腸吸收的影響

按照“2.2.2”配制濃度為 1mg/mL 吳茱萸醇提物作為對照組溶液，另取1mg/mL吳茱萸醇提物溶液加入維拉帕米(0.1mg/mL)作為維拉帕米組溶液。取SD大鼠10只，按照“2.4.1”的實驗步驟進行原位腸循環灌注，定時取樣，測定各時間點的吳茱萸堿、吳茱萸次堿的濃度，然后按照“2.4.2”計算其Ka、Papp，結果見表 1。

表1 P－gp抑制劑對吳茱萸生物堿腸吸收動力學參數(±s，n=5)

表1 P－gp抑制劑對吳茱萸生物堿腸吸收動力學參數(±s，n=5)

吳茱萸堿 吳茱萸次堿維拉帕米 Ka 0.727 ±0.027 0.674 ±0.016 Papp×10－6cm·s－11.251 ±0.021 1.163 ±0.051對 照Ka 0.482 ±0.019 0.411 ±0.010 Papp×10－6cm·s－10.894 ±0.106 0.731 ±0.064

2.5.2 不同濃度五味子提取物對吳茱萸生物堿腸吸收研究

按照“2.2.3”分別配制加高、中、低濃度五味子提取物的腸流液作為供試品溶液。取SD大鼠15只，隨機分成三組，按照“2.4.1”的實驗步驟進行原位腸循環灌注，定時取樣，測定各時間點的吳茱萸堿、吳茱萸次堿的濃度，然后按照“2.4.2”計算其Ka、Papp，結果見表 2。

表2 不同濃度五味子提取物對吳茱萸生物堿腸吸收動力學參數(±s，n=5)

表2 不同濃度五味子提取物對吳茱萸生物堿腸吸收動力學參數(±s，n=5)

吳茱萸堿 吳茱萸次堿五味子低劑量組 Ka 0.756 ±0.025 0.663 ±0.021 Papp×10－6cm·s－11.208 ±0.109 1.062 ±0.046五味子中劑量組Ka 0.771 ±0.030 0.625 ±0.020 Papp×10 －6cm·s－1 1.345±0.091 1.092±0.088五味子高劑量組Ka 0.774 ±0.020 0.623 ±0.023 Papp×10 －6cm·s－1 1.131±0.135 0.922±0.107對照組Ka 0.482 ±0.019 0.411 ±0.010 Papp×10－6cm·s－10.894 ±0.106 0.731 ±0.064

由以上各表可知，加入P－gp抑制劑維拉帕米(VP)與正常組相比，吳茱萸堿和吳茱萸次堿的吸收速率常數(Ka)和表觀滲透系數(Papp)都顯著增加(P＜0.05)。這種吸收促進作用是通過抑制P－gp外排而起作用的，提示吳茱萸堿、吳茱萸次堿可能是P－gp底物。加入五味子提取物與正常組相比，吳茱萸堿和吳茱萸次堿的吸收速率常數(Ka)和表觀滲透系數(Papp)都顯著增加(P＜0.05);但在考察的五味子濃度范圍以內，高中低濃度組組間對比，吸收速率常數(Ka)和表觀滲透系數(Papp)卻沒有顯著差異(P ＞0.05)。

3 討論

小腸是口服藥物的主要吸收部位，藥物的腸吸收在一定程度上能夠反映口服后的整體吸收情況。大鼠原位腸灌流模型能夠反映腸道的真實環境，排除肝臟的首過效應和藥物在腸壁組織中的代謝等生物轉化，與人體實驗相關性良好［8－9］，并且具有良好的可操控性，簡便，快速，準確，在國內外藥物研究中已得到廣泛應用。但該法也有局限性，藥物必須以水溶液狀態存在。吳茱萸中的Evo和Rut水溶性均不好，因此考慮加入BSA，起到助溶作用。

目前關于五味子和吳茱萸的相互作用機制方面的研究不是很多，有文獻報道［10－11］吳茱萸某些成分可能為P－gp底物。通過本實驗結果初步推測五味子有效成分［12］和吳茱萸兩堿可能都為P－gp底物，在大鼠小腸，五味子提取物競爭性作用于P－gp，從而抑制了P－gp對吳茱萸兩堿的外排作用。加入P－gp抑制劑組吳茱萸兩堿的吸收有所增加，與文獻報道的結果不相符［13］，可能是由于所用模型不一樣所致。大鼠原位腸灌流實驗操作雖然簡單，但隨機因素太多，還需用細胞吸收模型進一步確證。

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