HPLC法同時(shí)測(cè)定活血止痛膠囊中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、Rb1的含量

★ 黃東 楊毅生 李杰 (江西省食品藥品檢驗(yàn)所 南昌330029)

活血止痛膠囊收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》中藥成方制劑第十二冊(cè)，由當(dāng)歸、三七、乳香(制)、冰片、土鱉蟲、自然銅(煅)等六味藥組成，功能為活血散瘀，消腫止痛。用于跌打損傷，瘀血腫痛。其中三七是方中主藥之一，具有散瘀止血，消腫定痛之功效。主要有效成分有三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1，為了控制質(zhì)量，建立高效液相色譜法測(cè)定制劑中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1的含量。

1 儀器與試藥

SHIMADZU LC－2010AHT型高效液相色譜儀。三七皂苷R1對(duì)照品(批號(hào):110745－200517)、人參皂苷Rg1對(duì)照品(批號(hào):110703－200726，含量測(cè)定以97.7%)、人參皂苷Rb1對(duì)照品(批號(hào):110704－200420)均由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供;活血止痛膠囊(江西昌諾藥業(yè)有限公司，批號(hào):91207、100205、100301)，缺三七的陰性樣品按處方工藝自制;乙腈為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件［1］

色譜柱:Diamonsil C18色譜柱(250mm ×4.6mm，5μm);流動(dòng)相:以乙腈(A)－水(B)為流動(dòng)相，進(jìn)行梯度洗脫(0～30分鐘，19%A;30～50分鐘，19% ～22%A;50～51分鐘，22% ～31%A;51～75分鐘，31%A;75～75.1分鐘，31% ～90%A;75.1～85分鐘;90%A;85～85.1分鐘，90% ～19%A;85.1～95分鐘，19%A)，流速:1.0mL/分;柱溫:35℃;檢測(cè)波長(zhǎng):203nm。進(jìn)樣量:20μL。圖譜見圖1。

2.2 溶液制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液 精密稱取三七皂苷R1對(duì)照品14.20mg，置10mL量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻;精密稱取人參皂苷Rg1對(duì)照品8.83mg和人參皂苷Rb1對(duì)照品11∶82mg，精密吸取上述三七皂苷R1對(duì)照品濃液2mL，置同一10mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻;即得。

2.2.2 供試品溶液 取裝量差異項(xiàng)下的本品內(nèi)容物，研細(xì)，取約5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入水飽和的正丁醇50mL，稱定重量，加熱回流2小時(shí)，放冷，再稱定重量，用水飽和的正丁醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液25mL，置分液漏斗中，用正丁醇飽和的氨試液洗滌2次(15mL，10mL)，再用正丁醇飽和的水洗滌2次(15mL，10mL)，取正丁醇液，蒸干，殘?jiān)蛹状际谷芙獠⒍哭D(zhuǎn)移至10mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液 取陰性樣品適量，按“2.2.2”項(xiàng)下的方法進(jìn)行操作，制得陰性對(duì)照溶液。

圖1 HPLC圖譜

2.3 線性范圍

分別精密吸取“2.2.1”混合對(duì)照品溶液 1，2，5，10，20，30μl注入液相色譜分析儀，以對(duì)照品進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，峰面積平均值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表1。

表1 對(duì)照品精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.4 精密度試驗(yàn)

精密吸取對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣5次，結(jié)果:三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、Rb1峰面積的RSD分別為0.6%、0.5%、0.6%，表明儀器精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取批號(hào) 100205 供試品溶液，于 0、6、10、16、24h分別測(cè)定，結(jié)果:三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、Rb1峰面積的RSD分別為1.6%、0.7%、2.3%，表明供試品溶液在24小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 重現(xiàn)性試驗(yàn)

取批號(hào)100205的樣品，分別取5份，依法制備供試品溶液并測(cè)定，結(jié)果三七皂苷R1的含量為0.3891mg/g，RSD 為 2.8%;人參皂苷 Rg1的含量為 1.9797mg/g，RSD 為 1.7%;人參皂苷Rb1的含量為 1.5245mg/g，RSD 為 2.2%，結(jié)果表明方法重復(fù)性良好。

2.7 回收率試驗(yàn)

精密稱取批號(hào)100205的樣品，研細(xì)，取約1g，共取6份，精密稱定，精密加入混合對(duì)照品的水飽和正丁醇溶液(三七皂苷 R1對(duì)照品濃度為:0.00824mg/mL;人參皂苷 Rg1對(duì)照品濃度為:0.028mg/mL;人參皂苷Rb1對(duì)照品濃度為:0.032mg/mL)50mL，按“2.2.2”供試品溶液制備溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、Rb1平均回收率(n=6)分別為95.3%、99.7%、100.1%，RSD 分別為 1.6%、1.2%、1.7% ，結(jié)果見表2。

表2 回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.8 樣品測(cè)定

依法測(cè)定了3批樣品，結(jié)果見表3。

表3 樣品測(cè)定結(jié)果 /mg·g－1

3 討論

試驗(yàn)中對(duì)供試品溶液提取方法及時(shí)間進(jìn)行了選擇:提取方法考察了加熱回流和超聲處理的前處理方法，結(jié)果表明加熱回流法較超聲處理法要提取更完全，故選擇加熱回流提取;提取時(shí)間考察了加熱回流1、2、3小時(shí)的情況，結(jié)果表明回流2小時(shí)較1小時(shí)要提取更完全，但和3小時(shí)無顯著差異，故選擇提取2小時(shí)。

［1］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典一部［S］.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:11