血管緊張素Ⅱ-2型受體與原發性高血壓的相關性研究

王 露，金梅花，徐清斌，馬 萍（.寧夏醫科大學，寧夏 銀川 750004；.寧夏醫科大學附屬醫院心內科，寧夏 銀川750004）

原發性高血壓（EH）是由多種環境因素、生活方式和遺傳因素共同作用所引起的一種多基因遺傳病，遺傳因素所起的作用越來越受到人們的重視，血管緊張素Ⅱ-2型受體（ATR2）基因是RAS系統的重要組成部分[1-2]。國外研究表明：AT2R基因的多態性與心腦血管疾病存在密切關系，但關于寧夏漢族高血壓人群是否存在關聯尚未見報道。

1 資料與方法

1.1 一般資料：以寧夏醫科大學總醫院心內科門診及健康查體中心漢族原發性高血壓患者及健康查體者（均為長期居住在寧夏自治區的漢族人）為研究對象。137例原發性高血壓患者的診斷符合2005年《中國高血壓防治指南》（修訂版）診斷標準，男71例，女66例，平均年齡（45.31±10.51）歲。排除繼發性高血壓病、過度飲酒、服避孕藥、冠心病、糖尿病、心肌病及肝、腎病史者。149例血壓值正常者（對照組）均為同地區體檢血壓正常者（收縮壓＜140 mm Hg，舒張壓＜90 mm Hg）（1 mm Hg=0.1333 kPa），男63例，女86例，平均年齡（42.75±11.47）歲。未服用任何降壓藥物，無肝、腎、甲狀腺疾病及糖尿病病史。

1.2 方法

1.2.1 血壓測量：征得所有調查者口頭知情同意，于清晨采用水銀柱袖帶血壓計測量基礎血壓，囑患者坐位，測量其右上臂血壓值（觀察對象需排空膀胱，每間隔2 min測量1次，共3次，取平均值）。

1.2.2 一般臨床資料的收集：收集患者的性別、年齡、身高、體重、脈率、既往史、吸煙飲酒史、家族史等一般資料，并計算體重指數。

1.2.3 血液標本的收集：肘靜脈處采集外周抗凝血10 ml，5 ml血清用于空腹血糖（Glu）、肝腎功能和血清總膽固醇（Tc）等生化指標測定，另外5 ml靜脈血EDTA-Na抗凝，-70℃冰箱保存備用，用于基因組DNA的提取。

1.2.4 基因組DNA的提取和PCR擴增：采用天根生化科技（北京）有限公司血液基因組DNA小量抽提試劑盒提取基因組DNA。引物設計利用Primer5.0軟件完成，由上海生工生物工程有限公司合成。上游引物序列（P1）：5'-GGA TTC AGA TTT CTC TTT GAA-3'，下游引物序列（P2）：5'-GCA TAG GAG TAT GAT TTA ATC-3'。多聚酶鏈式反應（PCR）總體積20μl：其中10×buffer 2μl，dNTP（2.5 mol/L）1.6μl，上下游引物（10μmol/L）各0.4μl，DNA模板1μl，rTaq（5 U/ul）0.1μl，ddH2O 14.5μl；反應參數為94℃預變性3 min進入循環，94℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸30 s，共循環40次，最后72℃終末延伸10 min。酶切體系10μl包括PCR產物5μl，AluI內切酶（10 U/ul） 0.5μl，10×buffer 1.5μl，ddH2O 3μl，37℃水浴過夜；擴增產物經含溴化乙錠的1.5%瓊脂糖凝膠電泳分型后在凝膠成像儀下觀察、保存酶切結果并鑒定基因型。

1.3 統計學處理：采用SPSS 19.0統計軟件進行分析，計量資料以均數±標準差（）表示，計數資料以頻數表示，組間均數比較計量資料做t檢驗，研究對象與Hardy-Weinberg平衡的符合程度、基因型頻率與等位基因頻率的比較采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義，二項逐步logistic回歸分析基因型與高血壓病易感性的關聯關系，計算出P值、比值比（odds ratio，OR）及95%的可信區間（con fi dence index，CI）。

2 結果

2.1 Hardy-Weinberg平衡檢驗：EH組和對照組的基因型分布及等位基因頻率分別進行χ2檢驗（EH組：χ2=5.9187，P=0.0519；NT組：χ2=5.9448，P=0.0512），結果顯示均符合Hardy-Weinberg平衡，表明入選人群符合隨機抽樣、來自同一群體，在遺傳學上可代表寧夏的漢族人群。

2.2 EH組和NT組一般臨床資料比較：兩組中在年齡、性別、總膽固醇上差異無統計學意義（P＞0.05），余各項指標EH組均高于正常對照組人群，差異有統計學意義（P＜0.05）。詳見表1。

表1 一般資料比較（ ）

表1 一般資料比較（ ）

注：①兩組之間男、女構成比的比較用四格表χ2檢驗P＜0.05

一般資料 EH組（n=137） NT組（n=149） P值年齡（x± ，歲） 45.31±10.51 42.75±11.47 0.051性別（男/女，例）① 71/66 63/86 0.106收縮壓（s x± ，mm Hg） 154.96±15.71 123.43±9.74 0.000舒張壓（s x± ，mm Hg） 94.95±9.51 75.7±7.57 0.000 GLU（s x± ，mmol/L） 5.36±0.1 5.03±0.54 0.001 TG（s x± ，mmol/L） 2.23±1.36 1.75±1.93 0.016 TC（s x± ，mmol/L） 5.81±1.12 5.62±3.33 0.524 HDL-C（s x± ，mmol/L） 3.65±1.11 3.31±0.98 0.007 x± ，mmol/L） 1.21±0.29 1.3±0.27 0.008 LDL-C（ss

2.3 兩組AT2R基因型及等位基因比較：受檢者DNA經PCR擴增后，可能會產生321bp、214bp、107bp三個片段，則AT2R的C3123A多態性的基因型可有純合子CC（僅見321bp）和AA（214bp，107bp），雜合子CA（321bp，214bp，107bp），因AT2R基因位于X-染色體，男性只有半合子，故女性有CC、CA、AA三種基因型，男性僅有CC、AA兩種基因型；以性別分男女亞組，兩亞組中EH及NT組各基因型分布及等位基因頻率相比無顯著差異（P＞0.05）。見圖1與表2。

圖1 AT2R基因C3123A多態性的基因型

表2 兩組基因型及等位基因分布比較[例（%）]

2.4 不同基因型及等位基因間基本資料比較：女亞組中AC+AA基因型平均動脈壓明顯高于CC基因型組（P=0.037＜0.05），余臨床資料相比，差異無統計學意義（P＞0.05）；男亞組中不同基因型組間各臨床資料相比，差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.5 AT2R基因C3123A多態性與高血壓相關性的二項逐步logistic回歸分析：以是否患有高血壓（0：否，1：是）為應變量，將基因型（女亞組：CC、AC+AA型分別為0、1；男亞組：CC、AA型分別為0、1）、年齡、BMI、BUN、血Cr、GLU、UA、TC、TG、HDL-C、LDL-C按男女亞組分別引入模型。采用logistic回歸方法（向前：LR），結果顯示：女亞組中AC+AA基因型（OR=2.823，P=0.014）及BMI（OR=1.516，P=0.000）、Cr（OR=1.057，P=0.007）、GLU（OR=1.996，P=0.024）增高為EH的危險因素；男亞組中BMI（OR=1.224，P=0.000）增高為EH的危險因素。

3 討論

人類AT2R基因位于X-染色體上約5kb，包含兩個內含子、三個外顯子，外顯子3編碼完整蛋白質序列，轉錄調控因子位于內含子1和啟動區域[1-2]。AT2R通過拮抗AT1R介導的Ang Ⅱ血管收縮效應來舒張血管進而調節血管張力[3-4]。

AT2R基因多個位點的多態性與心腦血管疾病都有關，Jin等發現3123A在女性中與高血壓有關，而在男性中則未發現相關性[3]；而Kang BY等研究卻表明C3123A基因多態性與EH無顯著相關[4]；Miyaki K等研究表明A等位基因對于日本中年男性食鹽攝入對血壓的影響起重要決定作用[5]；Kotani K等表明BMI為日本健康女性C3123A基因多態性標記[6]。

在本研究人群中，AT2R基因男女亞組中各等位基因頻率及基因型構成比均無顯著差異，故C3123A基因多態性分布與寧夏漢族原發性高血壓的發病無顯著相關；而3123A等位基因頻率男亞組為14.0%，明顯低于Miyaki K（40.1%）及Kang BY（33.66%）的報道[4]；女亞組中3123A等位基因頻率為30.7%略低于Kotani K（33.1%）及Kang BY（32.91%）的報道，其中高血壓患者A等位基因頻率為34.4%，略低于Kang BY（37.8%）；CC、CA、AA基因型頻率高血壓組及正常對照組分別為[5-6]：35.9%、59.4%、4.7%和47.7%、48.8%、3.5%，而Kang BY研究兩組中分別為50.0%、41.2%、8.8%及42.8%、38.8%、18.4%，存在明顯差異；本研究與既往研究存在一定差異，其原因可能為血壓水平受多基因遺傳及環境因素共同影響，不同種族、人群的遺傳背景差異很大，故樣本來源所致差異不可避免，加之不同實驗疾病選擇、樣本量大小、樣本篩選標準、統計方法選擇等可能存在不同，最終導致不同研究之間存在差異。

經二元logistic檢驗發現女亞組中AC+AA基因型為EH的危險因素，同時女亞組中AC+AA基因型平均動脈壓明顯高于CC基因型組，余臨床資料及男亞組中各等位基因組間臨床資料差異均無統計學意義（P＞0.05），且男女亞組各基因型及等位基因分布頻率差異無統計學意義（P＞0.05），綜上認為AT2R基因C3123A多態性位點可能不是該地區漢族人發生高血壓病的獨立危險因素，也不能確定該等位基因是原發性高血壓病的致病因子。

[1]Martin MM,Elton TS.The sequence and genetic organization of the human type 2angiotensin Ⅱ receptor[J].Biochem Biophys Res Commun,1995,209(3):554.

[2]Warnecke C,Willich T,Holzmeister J,et al.Efficient transcription of the human angiotensin Ⅱ type 2 receptor gene requires intronic sequence elements[J].Biochem J,1999,340(1):17.

[3]Jin JJ,Nakura J,Wu Z,et al.Association of angiotensin B type 2 receptor gene variant with hypertension[J].Hypertens Res,2003,26(3):547.

[4]Kang BY,Bae JS,Lee KO.Association Study Between the C3123A Polymorphism of the Angiotensin Ⅱ Type 2 Receptor Gene in the Human X Chromosome and Essential Hypertension in Koreans[J].Environmental Health and Toxicology,2005,25(1):39.

[5]Miyaki K,Hara A,Araki J,et al.C3123A polymorphism of the angiotensin Ⅱ type 2 receptor gene and salt sensitivity in healthy Japanese men[J].Journal of Human Hypertension,2006,20(6):467.

[6]Kotani K,Sakane N,Saiga K,et al.The angiotensin II type 2 receptor gene polymorphism and body mass index in healthy Japanese women[J].Annals of Clinical Biochemistry,2007,44(1):83.