參附注射液聯合細胞因子對急性髓性白血病HL-60細胞來源的樹突狀細胞誘導生成及功能的影響

任莉莉 問明 李淑青 宋子正 商琰紅 王素云 魏影非

白血病是一類起源于骨髓多能干細胞的惡性克隆性疾病，其發生和發展的主要原因是白血病細胞不能有效的激活T細胞而逃脫宿主免疫系統監視和清除。樹突狀細胞(DCs)是能激活初始型T細胞(native T cells)的專職抗原遞呈細胞(APC)［1］，在激發抗原特異性細胞毒性T淋巴細胞(CTL)引起的過繼性免疫治療腫瘤中具有重要地位，成為腫瘤免疫治療研究的熱點。但體內DCs的含量很少，難以滿足臨床應用的需要。研究表明，DCs可在體外誘導、擴增，并可體外有效激活、誘導特異性抗腫瘤免疫。但DCs體外培養需要大量細胞因子，有研究也通過體外試驗證實，應用粒-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)和白細胞介素-4(IL-4)，僅可使部分慢性髓性白血病(CML)原代細胞分化為DCs，且表面免疫分子表達低于正常細胞來源的 DCs，特別是 CD80、HLA-DR［2］。并且從急性髓細胞白血病(AML)細胞誘導培養DCs比CML細胞困難，以往的試驗相對集中在CML來源，AML來源研究的較少，因此，有必要進一步探索提高體外誘導AML來源DCs質量的方法。

1 材料與方法

1．1 主要試劑 重組人GM-CSF由華北制藥金坦公司惠贈;重組人IL-4為美國Pepprotech公司產品，比活性13 U/ng;異硫氰酸熒光素(FITC)-CD1a單抗、FITC-CD80單抗、藻紅朊熒光素(PE)-CD83單抗、PE-HLA-DR單抗為美國B-D公司產品;IFN-γ試劑盒為深圳晶美生物工程公司。噻唑蘭(MTT)購于Ameresco公司。藥品:參附注射液由雅安三九藥業有限公司提供;批號:050802。人急性髓性白血病細胞系HL-60細胞株由中國協和醫科大學天津血液病研究所惠贈。

1．2 儀器 潔凈工作臺(蘇州凈化設備廠)，恒溫CO2細胞培養箱(美國SHELDON公司)，低速離心機(日本KUBOTA)，倒置顯微鏡(日本Olympus公司)，流式細胞儀(Vantage美國B-D公司)，酶標儀(北京Bintag公司)。

1．3 方法 DCs的培養和測定參照 Choudhury等［1，2］的方法，并加以改良。

1．3．1 體外誘導HL-60DCs:取HL-60細胞(調節細胞濃度為5×105/ml)，選用 IL-4+GM-CSF(終濃度分別為 50 ng/ml、100 ng/ml)、不 同 濃 度 的 SFI(9．38 mg/ml、18．75 mg/ml、37．5 mg/ml、75 mg/ml、150 mg/ml，均為生藥濃度)及 IL-4+GM-CSF聯合不同濃度的SFI(濃度分別同上)三種不同組合于37℃，5%CO2條件下誘導培養HL-60細胞，在倒置顯微鏡下觀察細胞生長的動態變化。

1．3．2 DCs的流式細胞術分析:收集培養8～12 d的細胞，800 r/min離心10 min，取上清－20℃凍存留測細胞因子，細胞用PBS洗2次，以PBS懸浮細胞，調整細胞數為1×106/ml，分別加入抗FITC-CD1a、抗FITC-CD80、抗PE-CD83和抗PE-HLADR單克隆抗體，置暗處室溫下反應15 min，上機檢測。

1．3．3 DCs刺激同種混和淋巴細胞反應(allo-MLR):取培養的DCs，800 r/min離心10 min，用 PBS洗2次，加入絲裂霉素 C 25 μg/ml，37℃、飽和濕度、5%CO2培養箱中孵育 30 min，PBS洗3次作為刺激細胞。分離健康人外周血單個核細胞(PBMNC)，以完全培養基37℃、飽和濕度、5%CO2培養箱中孵育2 h，輕輕吸出懸浮細胞，作為同種異體淋巴細胞即效應細胞。將刺激和效應細胞分別用RPMI-1640完全培養基懸浮，調節細胞濃度為1×105/ml，分別以 1×103/孔、3×104/孔和1×104/孔刺激細胞加入96孔平底培養板，每組設3個復孔，再加入效應細胞1 ×105/孔。即 DC∶淋巴細胞比例為1∶100，1∶30，1∶10。同時設空白對照孔，即只加入1×105/孔效應細胞，設3個復孔。補充培養基至總體積200 μl。在37℃、飽和濕度、5%CO2培養箱中培養72 h后，每孔加入 MTT(5 mg/ml，每孔20 μl)繼續培養4 h后終止培養，1 500 r/min離心5 min，棄去孔內培養液。每孔中加入二甲基亞砜(DMSO)100 μl，振蕩混勻，560 nm檢測OD值，3孔OD值取均值命名為A。刺激指數(SI)=實驗孔A值/空白對照孔A值。

1．3．4 IFN-γ的測定:取上述凍存的上清，采用雙抗體夾心ELISA法測定IFN-γ的含量，具體方法參照深圳晶美生物工程公司的ELISA檢測試劑盒說明書。

1．4 統計學分析 應用SPSS 13．0統計軟件，多組均數間比較采用多因素方差分析;兩兩比較采用LSD和SNK-q法檢驗;采用析因設計的方差分析檢驗SFI與(GM-CSF+IL-4)聯合使用時的協同作用;采用直線相關分析 T細胞增殖反應與 DCs數量的相關關系，P＜0．05為差異有統計學意義。

2 結果

2．1 形態觀察 處理前HL-60細胞呈球形，懸浮生長，表面光滑。僅加入GM-CSF及IL-4培養2 d后，2組部分細胞體積增大、增殖并開始表現多形性，培養8～12 d左右時可見較多具有典型樹突狀突起的細胞。而單獨應用不同濃度SFI培養的HL-60細胞可見:150 mg/ml、75 mg/ml SFI處理孔細胞全部破碎死亡，37．5 mg/ml細胞增殖緩慢，18．75 mg/ml、9．38 mg/ml處理孔中細胞體積增大并增殖明顯，但培養至8～12 d均未見具有樹突狀突起的細胞。GM-CSF+IL-4聯合不同濃度 SFI誘導培養的HL-60細胞呈現不同的變化:150 mg/ml SFI組中細胞全部破碎死亡、75 mg/ml SFI組體積稍增大，但增殖緩慢，且樹突狀突 起 的 細 胞 少 見;但 在 37．5 mg/ml、18．75 mg/ml、9．38 mg/ml SFI處理孔中細胞體積增大并增殖，培養8～12 d左右時典型樹突狀細胞比例明顯增加(圖1)，尤以18．75 mg/ml SFI組 DCs形態的細胞比例最高，并可見細胞集落。

2．2 細胞表型變化 培養前 HL-60細胞 DCs表型 CD1a、CD80、CD83、HLA-DR表達很低。而單獨以 SFI誘導培養的HL-60細胞上述DCs表型表達仍不高。以GM-CSF+IL-4誘導8～12 d后，細胞表型表達率均高于培養前和單獨以SFI培養組，差異有統計學意義(P ＜0．05，HL-60DCs的 CD80除外)。以GM-CSF+IL-4和不同濃度SFI誘導培養后，HL-60細胞以18．75 mg/ml SFI+GM-CSF+IL-4培養的DCs標志表達最高，并顯著高于其他各組(P＜0．05)，且有很好的協同作用(P＜0．05)。GM-CSF+IL-4與其他濃度SFI聯用DCs表型表達率雖高于單用GM-CSF+IL-4培養組，但差異無統計學意義(P＞0．05)。見表 1。

2．3 DCs刺激同種異體T細胞增殖的能力 培養前HL-60細胞以及18．75 mg/ml SFI培養組僅有較弱的刺激T淋巴細胞增殖能力，且隨著效靶比增加，刺激能力沒有相應提高。在HL-60細胞中以GM-CSF+IL-4或SFI與GM-CSF+IL-4聯用培養的DCs，刺激T淋巴細胞增殖的能力顯著高于上述各組細胞。當效靶比為1∶100，1∶30，1∶10 時，刺激指數分別為 1．606 ±0．074 vs．2．280 ±0．097 vs．2．415 ±0．090 和 2．106 ±0．174 vs．2．728 ±0．125 vs．3．196 ±0．137(r=0．949，P ＜0．01)。并且SFI與GM-CSF+IL-4聯用組顯著高于GM-CSF+IL-4組(P＜0．05)。見表 2。

2．4 INF-γ的分泌水平 HL-60細胞不同組合條件下培養的上清中均有不同程度INF-γ的分泌，其中18．75 mg/ml SFI組INF-γ 含量低于 GM-CSF+IL-4組(P ＜0．01)。GM-CSF+IL-4聯合SFI組中GM-CSF+IL-4聯合18．75 mg/ml SFI組培養的HL-60細胞上清中INF-γ含量顯著高于GM-CSF+IL-4聯合其他濃度SFI培養的細胞(P＜0．01)，且有很好的協同作用(P＜0．05)。其他濃度SFI組含量不同程度的高于GM-CSF+IL-4組，但差異無統計學意義(P＞0．05)。見表3。

3 討論

急性白血病屬中醫急勞、虛癆、血證、癥積的范疇，本虛標實、虛實錯雜是本病的主要病機特征，治宜扶正祛邪，使毒祛瘀化，則正氣得復。目前隨著化療方案的改進，AML的完全緩解率不斷增加，然而無病生存的患者仍然有限，影響患者生存的主要原因就是微小殘留病灶導致的復發，即便造血干細胞移植仍存在復發的風險。

表1參附注射液對培養的HL-60DCs的細胞免疫表達的影響n=3，%，±s

表1參附注射液對培養的HL-60DCs的細胞免疫表達的影響n=3，%，±s

注:與誘導前組比較，*P ＜0．05，#P ＜0．01;與對照組比較，△P ＜0．05，☆P ＜0．01;與 SFI組比較，□P ＜0．05，○P ＜0．01;與 GM-CSF+IL-4 組比較，▲P ＜0．05，★P＜0．01;與 GM-CSF+IL-4+SFI(37．5)組比較，■P ＜0．01;與 GM-CSF+IL-4+SFI(18．75 組)比較，●P ＜0．01

CD83 CD1a HLA-DR CD80誘導前組組別 SFI(mg/ml)表達情況0．74 ±0．57 1．07 ±0．71 0．52 ±0．51 0．51 ±0．41對照組 0 0．87 ± 0．42 1．46 ±0．76 0．77 ±0．31 0．72 ±0．20 SFI組 18．75 1．80 ±0．84 2．08 ±0．76 1．26 ±0．95 2．94 ±2．20 GM-CSF+IL-4 組 0 8．33 ±1．76#☆○ 11．86 ±3．86＊△□ 0．77 ±0．31＊△□ 0．77 ±0．31 GM-CSF+IL-4+SFI組 37．5 11．93 ±3．19#☆○ 14．90 ±6．89#☆○★ 14．06 ±4．84#☆○▲ 11．38 ±4．79#☆○★18．75 18．75 ±6．18#☆○★■ 24．32 ±7．44#☆○★■ 26．99 ±7．42#☆○★■ 18．24 ±3．13#☆○★■9．38 9．33 ±1．05#☆○● 13．74 ±3．79#☆○● 15．03 ±3．89#☆○▲■ 10．02 ±3．67#☆○★●0

表2 參附注射液對培養的HL-60DCs刺激T細胞增殖反應的影響

表3 參附注射液對培養的HL-60DCs培養上清液中INF-γ含量的影響n=3，±s

表3 參附注射液對培養的HL-60DCs培養上清液中INF-γ含量的影響n=3，±s

注:與誘導前組和對照組比較，*P ＜0．05，#P ＜0．01;與SFI組比較，△P ＜0．01;與 GM-CSF+IL-4 比較，☆P ＜ 0．05，□P ＜ 0．01;與 GM-CSF+IL-4+SFI(37．5)組比較，○P ＜0．05;與 GM-CSF+IL-4+SFI(18．75)組比較，▲P ＜0．01

HL-60 cells/HL-60-DCs誘導前組組別 SFI(mg/ml) IFN-γ濃度(pg/ml)15．52 ±4．03對照組 0 15．75 ±5．07 SFI組 18．75 22．89 ±7．58 GM-CSF+IL-4 組 0 37．35 ±8．31*GM-CSF+IL-4+SFI組 37．5 56．67 ±10．38#△☆18．75 73．34 ±14．40#△□○9．38 45．65 ±9．34#△▲0

圖1 HL-60-DCs(Wright×1 000)

DCs起源于髓系，是迄今所知人體內最強大的抗原遞呈細胞，能誘導原發和繼發的免疫應答，激活輔助T細胞和細胞毒性T細胞，從而產生強大的抗腫瘤效應，因此DCs用于免疫治療AML具有十分廣闊的前景。目前雖然用體外培養的方法可將白血病細胞誘導分化成為DCs，但只能使一部分白血病細胞分化為DCs，且多數白血病細胞來源的DCs表面分子的熒光強度低于正常來源的DCs，特別是CD80、HLA-DR，而二者是APC細胞與T細胞相互作用中最重要的信號分子，故它們的表達率和表達量常會影響T細胞的激活和功能［3］。因而如何提高DCs的產量及成熟度，激活其功能，更有效而特異的殺死白血病細胞是白血病免疫治療的研究熱點。

來源于《濟生方》或《濟生續方》中參附湯的 SFI及其組分——人參、附子均具有調節改善機體免疫的功能，可誘導造血基質細胞表達 GM-CSFmRNA，促進 TNF-α、IL-1、IL-2等細胞因子的產生，配合化療可改善白血病患者正氣不足之狀［4－6］，提示SFI可能參與調節DCs抗原提呈功能，因此本試驗通過檢測代表DCs成熟及功能的幾個指標來研究SFI是否參與調節DCs的功能。

本實驗發現在GM-CSF/IL-4聯合適當濃度(18．75 mg/ml、37．5 mg/ml)SFI的作用下，白血病細胞可以誘導分化為DCs，能明顯增強白血病-DCs表型(CD1a、CD80、CD83、HLA-DR)的表達率，另外還發現SFI對于白血病細胞存在雙向調節作用。SFI在低濃度18．75 mg/ml和9．38 mg/ml時可促進HL-60DCs細胞的增殖。而在150 mg/ml和75 mg/ml濃度時，可導致HL-60細胞全部破碎死亡或增殖緩慢，而這種雙向調節作用究竟是何種機制在發揮作用，還有待進一步的研究證實。

我們前期的試驗證實與本試驗結果相似。雖然單獨應用SFI不能誘導DCs的生成，但GM-CSF+IL-4聯合適當濃度的SFI能更有效地誘導DCs的生成和成熟。不同濃度的SFI對不同來源DCs誘導生成作用不同:誘導CML患者的PBMNCs和K-562細胞，SFI的最佳誘導濃度為75 mg/ml，對HL-60細胞則為18．75 mg/ml，且在相應的濃度下與GM-CSF及IL-4聯合使用時有很好的協同作用，SFI對不同來源的細胞，有不同的最適濃度，可能與不同細胞對SFI敏感性不同有關，增殖速度快的細胞對SFI更敏感。

綜上所述，SFI可以聯合GM-CSF和IL-4誘導HL-60細胞成為成熟的DCs，使其抗原遞呈功能明顯增強，分泌INF-γ，并表現雙向調節作用。當然，還有很多問題需要我們進一步探索，如，SFI畢竟為中藥的混合制劑，其中的主要藥物成分人參皂甙和烏頭堿在調節免疫中究竟起協同還是拮抗作用，還是某一種成分的單獨作用;烏頭堿的心臟、神經毒性眾所周知，怎樣通過合理的比例使之更適合發揮免疫調節作用并避免不良反應;SFI在體內有無誘導DCs生成及促進DCs增殖和遞呈抗原的功能等。相信隨著研究的深入，必將會揭示SFI抗腫瘤機制的實質，為SFI配合治療白血病提供可靠的依據。

1 劉開揚，張洪泉．中西醫結合抗腫瘤的免疫學機制研究進展．時珍國醫國藥，2008，19:2049-2050．

2 王俊祥，王金鎧，鄭師陵，等．人慢性髓性白血病細胞系來源的樹突狀細胞免疫功能的體外研究．南京醫科大學學報(自然科學版)，2003，26:579-590．

3 Fan P，Wu ZH，Wang S．An Investigation on the phenotype of cultured dendritic cells from the peripheral blood of patients with breast cancer．Journal Of Nanjing Medical University Ann Hematol，2002，16:115-120．

4 Oehler L，Berer A，Kollar M，et al．Culture requierments for induction of dendritic cell differentiation in acute myeloid leukemia．Ann Hematol，2000，79:355-362．

5 陳玉春．人參、附子與參附湯的免疫調節作用機理研究．中成藥，1994，16:30-31．

6 王勇，王莎莉，王亞平，等．人參皂甙對人骨髓造血因子活性及其mRNA 表達的影響．解剖學報，1999，30:362-366．