高脂飲食脂肪肝胰島素抵抗大鼠中PPARα的表達對肝組織的影響

王素格 李德征 蔣樹林 秦明月

近年來人們生活水平日益提高，而日常膳食中以脂肪為代表的高熱量食物成分所占比例明顯增加，使非酒精性脂肪肝炎(non alcoholic steatohepatitis，NASH)的發病率日益增長［1］，從而成為人們普遍關注的問題。有大量研究發現，胰島素抵抗(IR)是NASH發病的首要環節［2－4］，而過氧化物酶體增殖物激活 受 體 α(peroxisomeproliferator-activated receptoralpha，PPARα)是調節胰島素敏感性的一個重要因子，并且它的激動劑可能減少肝臟的脂質沉積，從而使脂肪性肝炎得到改善，因此我們通過高脂飲食誘導脂肪肝胰島素抵抗模型的成立，然后觀察IR及PPARα的mRNA在NASH中的表達情況，為NASH的治療提供新的藥物作用靶點。

1 材料與方法

1.1 建立動物模型 雄性SD大鼠60只，體重120～160 g，鼠齡4～6周，分籠飼養在溫度22～28℃動物室中，明暗各12 h，自由進食及飲水，適應性飼養1周后，隨機分為4組，正常組20只、高脂組20只，實驗組10只、實驗對照組10只。正常組喂飼普通飼料;高脂組、實驗組、實驗對照組喂飼高脂飼料［5，6］，其配方:普通飼料加1%膽固醇和10%蛋黃粉、10%豬油，－20℃冰箱保存，喂前平衡室溫。12周末時正常組與高脂組各取10只一并進行鉗夾及肝組織石蠟切片HE染色，確定胰島素抵抗脂肪肝動物模型造模成功;實驗組在高脂飲食同時給予非諾貝特80 mg·kg－1·d－1灌胃;實驗對照組將高脂飲食改為正常飲食;實驗組每天定時給藥，其余各組均給予等體積的0.9%氯化鈉溶液灌胃，持續4周后所有大鼠分別測定胰島素敏感性，然后處死大鼠留取所需標本。

1.2 主要試劑 膽固醇購自南京新百藥業有限公司，豬油由河北醫科大學實驗動物中心提供，非諾貝特(力平之)200 mg為法國利博福尼公司產品，丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉移酶(AST)、三酰甘油(TG)、膽固醇(TC)采用德國Bbyer公司的全自動血清生化分析儀檢測，由河北醫科大學第二醫院生化室協助。RNA提取試劑盒及GAPDH均為北京賽百盛基因技術有限公司產品。

1.3 觀察指標及測定方法

1.3.1 一般情況:每天觀察動物的毛色、活動及糞便與進食水情況，每周測定大鼠體重。

1.3.2 空腹血清TC、TG、ALT、AST及血糖測定:用全自動生物化學分析儀測定，全部應用酶法完成。

1.3.3 病理學檢查:中性甲醛固定肝標本，石蠟包埋，常規切片行HE染色，光鏡下觀察肝臟脂肪變性及炎癥的程度。由富有經驗的病理醫生在不知分組情況下作出診斷。對肝脂肪變性和炎性細胞浸潤程度分級、評分判斷標準參照文獻［7－9］。

1.3.4 IR的測定:用正常血糖高胰島素鉗夾技術［10］，求取60～120 min的13個GIR的平均值，該指標反應大鼠的胰島素敏感性，GIR越小，機體的IR越嚴重。

1.3.5 PPARα的mRNA表達水平的測定:鉗夾結束后迅速取出肝臟組織，冰上取肝臟同一部位切取1塊肝組織約100～150 mg，將組織放入高壓處理的EP管中，編號記錄后迅速液氮冷凍保存，采用RT－PCR法檢測PPARαmRNA的表達。根據參考文獻選取引物并合成，PPARα(Gen Bank網站)上游引物:5′－CCTGGAAAGTCCCTTATCT－3′，下 游 引 物:5′－GCCCTTGCAGCCTTCACAT－3′，319 bp，GAPDH 上游引物:5′－TCCCTCAAGATTGTCAGCAA－3′，下游引物:5′－AGATCCACAACGGATACATT－3′，308 bp。

①RNA提取:用Trizol一步法提取總RNA，按說明書進行。②逆轉錄:用20 μl體系逆轉錄RNA ，取總RNA 2 μl，隨機引物(dN)9 1 μl，DEPC 處理水 7 μl，5 × MMLV buffer 4 μl，dNTP 2 μl Rnasin 10 U/μl，MMLV RTase 1 μl，100 m MDTT 2 μl，70℃5 min，37℃ 1 h 94℃ 5 min。③PCR 反應體系 20 μl:取2 μl逆轉錄產物進行 PCR，10 × Taq 緩沖液2 μl，PCR 染料2 μl，Taq DNA聚合酶 0.2 μl，0.1 mmol/L，dNTP，上下游引物各20 pmol。PCR擴增反應條件為:預變性 94℃、5 min、1 min;變性 94、30 s，退火(PPARα 56℃;GAPDH 56℃)40 s，延伸 72℃、45 s，循環數(PPARα 35次;GAPDH 30次)，終末延伸 72℃、10 min。模板量及循環次數經檢測均在線性范圍內。PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳后，以UVP計算機圖像掃描分析系統Robocycler 4.0測定電泳條帶密度值，以GAPDH為內參照，Excel計算PPARα基因mRNA的相對含量，結果以PPARα條帶占GAPDH條帶密度的百分率表示。

1.4統計學分析應用SPSS 14.0統計軟件，計量資料以±s表示，采用t檢驗、秩和檢驗、方差分析和直線相關分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況 4組大鼠均生長良好，至實驗結束時無1例死亡。正常對照組大鼠精神充沛，靈活好動，皮毛整潔，而高脂組性情溫順，喜臥懶動，皮毛凌亂，光澤度差。實驗前各組體重差異無統計學意義(P＞0.05)，具有可比性。12周末時，高脂組及各給藥組與正常組比較，體重均明顯增加(P＜0.05)。實驗結束時，實驗組及實驗對照組與高脂組比較，體重減輕(P＜0.05)，而高脂組體重比正常組顯著增高(P＜0.01)。見表1。

表1大鼠體重的變化n=10，g，±s

表1大鼠體重的變化n=10，g，±s

注:與正常組比較，*P ＜0.05;與高脂組比較，#P ＜0.05

組別 0周 12周 16周167±16 365±25 408±39高脂組 170±14 440±21* 496±20實驗組 178±9 457±39* 428±43*#實驗對照組 181±9 440±41* 460±25*#正常組

2.2 血清ALT、AST、TC及TG的變化 實驗結束時，高脂組ALT、AST較正常組顯著增高(P＜0.01);與實驗組及實驗對照組比較，AST明顯降低(P＜0.01)，而ALT仍高于正常范圍，差異無統計學意義(P ＞0.05)，但有下降趨勢，TC、TG明顯降低(P ＜0.01)。見表2。

表2大鼠血清生化學指標的變化n=10，±s

表2大鼠血清生化學指標的變化n=10，±s

注:與正常組比較，*P ＜0.05;與高脂組比較，#P ＜0.05

組別 TC(mmol/L) TG(mmol/L) ALT(U/L) AST(U/L)1.14±0.13 0.24±0.05 42±7 92±21高脂組 2.18±0.25* 0.46±0.08* 56±12* 127±30*實驗組 1.47±0.37*# 0.23±0.05# 50±9 102±14#實驗對照組 1.66±1.98*# 0.34±0.07*# 52±8 117±23正常組#

2.3 肝臟病理學觀察 正常組大鼠肝臟無異常變化。高脂組肝臟體積明顯增大，包膜緊張，邊緣變鈍，顏色呈土黃色，甚至可見局灶性黃白色變性灶，與周圍組織有粘連，切面油膩。實驗組及實驗對照組部分肝臟顏色接近正常，表面呈淺黃色，油膩減輕。

光鏡下，正常組大鼠肝臟組織HE染色未見明顯異常(圖1 A);高脂組肝細胞均呈彌漫性脂肪變性，肝細胞脂肪變性面積達到2/3以上，肝細胞界限不清，肝竇狹窄，部分肝組織在脂肪變的基礎上伴有小葉內炎癥，大部分出現匯管區炎癥，小葉內有灶性壞死，壞死灶周圍有大量炎細胞浸潤，無肝纖維化(圖1 B);實驗組及實驗對照組脂肪變程度較高脂組明顯減輕，未見明顯肝細胞壞死(圖1 C、D);進一步脂肪變及炎癥程度評分統計結果示:高脂組10例中脂變程度2級4例，3級6例，10例均為脂肪性肝炎;而實驗組及實驗對照組脂肪變及炎癥程度均明顯減輕，與正常組比較差異有統計學意義(P＜0．01)，實驗組與實驗對照組間差異無統計學意義(P＞0．05)。

圖1 4組肝組織光鏡表現

2．4 血糖、葡萄糖輸注率、PPARαmRNA表達的變化 16周末，正常組空腹血糖與高脂組、實驗組及實驗對照組比較，差異均無統計學意義(P＞0．05)，但高脂組有增高趨勢;GIR 60～120中正常組與高脂組、實驗組及實驗對照組比較差異有統計學意義(P＜0．05)。高脂組與實驗組、實驗對照組比較有統計學意義(P ＜0．05)。PPARα mRNA變化規律為:實驗組、正常組、實驗對照組、高脂組表達量依次降低，高脂組與實驗組比較有統計學意義(P＜0．05)。見表3。

表3 4組大鼠血糖、葡萄糖輸注率及暉度比值的比較

3 討論

NASH是以肝細胞脂肪變性、灶性壞死及小葉內炎癥為特征的遺傳一環境一代謝應激相關的臨床病理綜合征，有研究表明IR是NAFLD發病的主要環節，它使機體脂質代謝平衡紊亂，導致肝細胞內脂質積聚，然后是氧自由基引起脂質過氧化反應及其以瀑布效應誘發的炎癥反應，而PPARs是一種新型甾體類激素受體，也是配體激活轉錄因子，包括PPARα、PPARβ、PPARγ3種亞型，PPARα主要表達于肝臟、腎臟、心臟和肌肉等進行脂肪酸氧化的組織中，在脂肪肝、胰島素抵抗的發生發展中有著重要影響。本研究發現FC組大鼠肝組織中PPARα的mRNA比NC組明顯降低，IR明顯加重，肝臟脂肪變呈中重度改變;許多學者研究發現PPARα激活劑是防治NASH的一種新策略，而目前已經明確PPARα激動劑是貝特類調脂藥，對NASH的治療作用受到廣泛關注。本研究結果顯示，與FC組相比，FF組與FR組PPARα的mRNA表達均明顯增強，從而IR改善，肝脂肪變及炎癥壞死明顯減輕，血中TG降低，以上結果表明PPARα激動劑可改善IR，使肝臟脂肪變及炎癥程度減輕，降低血中TG水平，阻止NASH進展，機制可能是由于PPARα被激活后一方面直接促進肝內脂肪酸的氧化，使合成的脂肪酸和局部脂肪酸水平降低，從而減輕了脂質的沉積，改善胰島素抵抗;另一方面可直接改善肝臟脂蛋白和脂質代謝的基因，使肝臟FFA的β-氧化增加，減少肝內脂質的沉積。值的一提的是非諾貝特組與改良組在改善脂肪變上無統計學意義(P＞0．05)，說明在藥物干預的同時，仍然堅持不良的生活習慣，將難以控制肝臟脂肪變性，而改變不良的飲食習慣，是防治IR的根本。但也有研究表明激活PPARα調節過氧化物酶體、微粒體中參與脂肪酸氧化的酶的表達，其持續活化在脂肪酸氧化增強的同時，也產生大量的H2O2及活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)，在單純性脂肪肝的基礎上發生脂質過氧化，促進脂肪性肝炎、脂肪性纖維化的形成和發展［13－14］。

綜上所述，PPARα、IR及NASH之間關系錯綜復雜，深人探討它們之間的相關性將為NAFLD的發病機制提供有利的證據，并為其有效的防治提供新的思路。

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