原發性膽汁性肝硬化患者自身抗體檢測的臨床分析

齊國海 張鳳蘭 寧新麗 趙彥叢

原發性膽汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis，PBC)是一種發病機制未明卻與自身免疫系統有關的慢性肝病，組織病理學檢測可發現肝內小膽管有非化膿性炎性病變。有研究顯示，90%以上的PBC患者其血清中能夠檢測到抗線粒體抗體(antimitochondrial antibodies，AMA)，因此，可以將 AMA 作為診斷PBC的有效血清學標志［1］。采用間接免疫熒光法(indirect immunofluoresence，IF)檢測PBC患者血清時，其中會出現兩種不同抗核抗體(antinuclear antibody，ANA)的熒光染色，即多核點型(multiple nuclear dots，MND)ANA和核膜型 (nuclear envelope，NE)ANA，這兩種抗體可被看作PBC的血清學特異性抗體［2］。而MND-ANA主要能識別兩種細胞核蛋白，即Sp100和早幼粒細胞白血病抗原(promyelocytic leukemia antigen，PML)［3］。本研究應用 IF及免疫印跡法(immunology blot，IB)對60例PBC患者血清中的MND-ANA和抗-Sp100抗體進行檢測，探討MND-ANA以及抗-Sp100抗體用于疾病的診斷和在臨床中的意義。

1 資料與方法

1．1 一般資料 選取涉縣醫院2009年1月1日至2011年10月30日的住院及門診PBC患者60例(研究組)，其中男14例，女46例;年齡30～76歲，平均年齡(56±10)歲。對照組選擇涉縣醫院同期住院及門診患者43例，其中慢性乙型肝炎10例，慢性丙型肝炎7例，干燥綜合征12例，自身免疫性肝炎7例，健康者7例。每例患者臨床資料均詳細可查。采集2組血清，－20℃保存待測。診斷標準參照［4－6］。肝臟病理學檢查:選擇PBC患者中的50例行肝臟病理檢查，所取肝組織常規石蠟包埋，HE與Masson染色，閱片由同一位高年資病理醫師進行。

1．2 方法 以IB法檢測肝特異性自身抗體AMA-M2、平滑肌抗體(SMA)、核點蛋白SP100抗體、肝腎微粒體1型(LKM-1)抗體、GP210抗體和肝細胞溶質抗原I型(LC-1)抗體。以IF檢測肝ANA、可提取性核抗原(ENA)多肽抗體譜和雙鏈DNA(ds-DNA)。以免疫散射比濁法檢測免疫球蛋白IgA、IgM、IgG和補體 C3、C4。

1．3 組織學分期標準［7］Ⅰ期為匯管區炎癥僅限于匯管三角;Ⅱ期為顯著的匯管及匯管周圍炎癥，且無間隔纖維化或橋接樣壞死;Ⅲ期為小葉纖維化和(或)橋接樣壞死;Ⅳ期為肝硬化。

1．4統計學分析應用SPSS 10．0統計軟件，計量資料以±s表示，采用t檢驗，計數資料比較采用 χ2檢驗，P ＜0．05為差異有統計意義。

2 結果

2．1 IF法檢測患者的ANA結果 檢測患者的ANA結果通過RBE細胞觀察其中的60例ANA免疫熒光模式，結果顯示25．0%(15/60)呈現 MND 熒光染色陽性，15．0%(9/60)呈現核膜型，8．3%(5/60)呈現著絲點型，均質型2例，斑型6例。15例MND-ANA陽性患者中AMA陰性PBC患者5例，AMA陽性PBC患者10例。對照組12例干燥綜合征患者中有MND-ANA陽性1例，著絲點型1例，斑型5例。7例自身免疫性肝炎患者中均質型ANA 4例，斑型ANA 1例，MND-ANA陽性2例。而慢性乙型肝炎、慢性丙型肝炎和健康者對照均為陰性。見表1。

表1 IF檢測患者的ANA結果 例

2．2 PBC患者抗-SP100陽性和陰性的臨床結果 抗-SP100陽性和陰性PBC患者的相關結果差異無統計學意義(P＞0．05)，但IgG差異有統計學意義(P ＜0．05)。見表2。

表2PBC患者抗-Sp100陽性和陰性的相關結果±s

表2PBC患者抗-Sp100陽性和陰性的相關結果±s

項目 抗-Sp100陽性(n=17) 抗-Sp100陰性(n=43) P值55±7 57±11 ＞0．05 ALT(U/L) 90±17 90±21 ＞0．05 AST(U/L) 1 667±1 184 1 634±1 084 ＞0．05 ALP(U/L) 412±51 418±54 ＞0．05 GGT(U/L) 318±68 324±68 ＞0．05 TBIL(μmol/L) 35±22 36±30 ＞0．05 IgG(g/L) 24±6 15±5 ＜0．05 IgA(g/L) 5．2 ±1．5 4．6 ±2．4 ＞0．05 IgM(g/L) 6．0 ±3．9 5．8 ±2．8 ＞0．05 AMA［例(%)］ 17(100) 43(100) ＞0．05病理早期(Ⅰ/Ⅱ，例) 6 17病理晚期(Ⅲ/Ⅳ，例)年齡(歲，images/BZ_562_2176_2014_2208_2059.png±s)7 20 ＞0．05

3 討論

有文獻證實 MND-ANA能夠識別位于核體上的蛋白［2］。核體是與核基質相關的多蛋白復合體，它主要包括NDP55、PML、Sp 100和rfp及SUMO-1等。Sp 100蛋白是一種磷酸化的細胞核蛋白，在電泳移動中其相對分子量為100 ku。Szostecki等［8］首先觀察到PBC患者血清中的MND-ANA能識別分子量約100 ku的蛋白，并且將其命名為Sp 100。目前，已知的是Sp 100為轉錄活化因子中的一種，適當條件下能觀察到Sp 100蛋白和mRNA的升高狀態。此外目前對Sp100的其他功能所知較少。

跟其他自身免疫性疾病相似，在PBC患者的血清中除去AMA外還有ANA存在，使用IF法檢測此類血清時，ANA的染色模式分別有斑型、MND、核膜型、著絲點型和均質型以及核仁型等，本研究結果揭示MND及核膜型的ANA可被認為是PBC患者的特異性自身抗體。有研究描述了MND-ANA免疫熒光的模式，并且發現它的特點是有3～20個大小(0．3～1 μm)不一的點狀染色出現，分布位置是除核仁外的整個細胞核中［9］。

本研究中使用IF法檢測60例PBC患者的血清，發現有15例MND-ANA陽性，陽性率為25．0%;對照組僅在干燥綜合征和自身免疫性肝炎患者分別出現1例陽性，由此可推斷MND-ANA是PBC的特異性自身抗體，與相關研究［8］結論相符。Luettig等［10］對施行肝移植手術后的PBC患者的跟蹤隨訪資料發現，移植術后盡管ANA的滴度下降趨勢明顯，但血清中的ANA仍呈持續存在狀態，且其免疫熒光反應模式也幾乎未改變。這就更加顯著地揭示了MND-ANA確為PBC的特異性自身抗體，甚至是病變靶器官已經被去除的狀態下該抗體依然能被檢測到。本研究在IF的基礎上，又采用免疫印跡法檢測分析MND-ANA陽性的PBC患者體內的抗-Sp100抗體。在所選擇的全部60例PBC患者中，檢測到抗-Sp100陽性17例，陽性率為28．3%，而對照組中只有1例患者檢測到抗-Sp100，這也提示了抗-Sp100是PBC特異性的血清自身抗體。

AMA是診斷PBC的血清學標志物之一，有研究采用IF法檢測AMA的陽性率約為80%，但換用敏感性更好的檢測方法如免疫印跡法或者酶聯免疫吸附法后，仍會有5%～10%的PBC患者出現AMA陰性［11］。結合本研究結果和文獻［9］，筆者建議如果有臨床與組織學的檢查結果均符合PBC的診斷標準而AMA陰性情況的患者，進一步選擇MND-ANA檢測可能會有助于診斷PBC，這樣也可以避免遺漏和延誤AMA陰性的PBC患者的診斷。

本文也比較了抗-Sp100陰性和陽性PBC患者的相關臨床資料，結果顯示這兩類患者在年齡和生化指標以及病理分期方面差異無統計學意義(P＞0．05)，但在免疫學指標中IgG的水平陽性患者高于陰性患者(P＜0．05)。抗-Sp100能否作為判斷PBC患者病情及預后的有效指標，還有待于收集整理更多的患者資料進行細致而長期的臨床觀察。本研究結果提示在PBC病變的早期(Ⅰ/Ⅱ)抗-Sp100陽性率跟晚期(Ⅲ/Ⅳ)無差異(P＞0．05)，揭示了抗-Sp100是在PBC的病變早期時即已經存在。

本研究顯示，抗核抗體在PBC中的陽性率較高，實際操作中可作為PBC的初篩實驗;另外其在PBC中以核膜型為主，而著絲點型次之，臨床醫療工作中，若其ANA結果呈現高滴度的核膜型，可作為一個提示，提醒臨床醫生檢測抗線粒體，來判斷此患者體內是否有抗線粒體抗體存在，從而為PBC的早期診治提供依據。

1 Kaplan MM．Primary biliary cirrhosis．N Engl J Med，1996，335:1570-1580．

2 Worman HJ，Courvalin JC．Antinuclear antibodies specific for primary biliary cirrhosis．Autoimmun Rev，2003，2:211-217．

3 邵杰，魏來，王豪，等．原發性膽汁性肝硬化患者中多核點型核抗體的檢測．世界華人消化雜志，2005，13:1478-1481．

4 Heathcote EJ．Management of primary biliary cirrhosis．The American Association for the Study of Liver Diseases practice guidelines．Hepatology，2000，31:1005-1013．

5 Vitali C，Bombardieri S，Jonsson R，et al．Classification criteria for Sjogren＇s syndrome:a revised version of the European criteria proposed by the A-merican-European Consensus Group．Ann Rheum Dis，2002，61:554-558．

6 Alvarez F，Berg PA，Bianchi FB，et al．International Autoimmune Hepatitis Group Report:review of criteria for diagnosis of autoimmune hepatitis．J Hepatol，1999，31:929-998．

7 Ludwig J，Dickson ER，McDonald GS．Staging of chronic nonsuppurative destructive cholangitis(syndrome of primary biliary cirrhosis)．Virchows Arch A Pathol Anat Histol，1978，379:103-112．

8 Szostecki C，Krippner H，Penner E，et al．Autoimmune sera recognize a 100 kD nuclear protein antigen(sp-100)．Clin Exp Immunol，1987，68:108-116．

9 Szostecki C，Guldner HH，Will H．Autoantibodies against“nuclear dots”in primary biliary cirrhosis．Semin Liver Dis，1997，17:71-78．

10 Luettig B，Boeker KH，Schoessler W，et al．The antinuclear autoantibodies Sp100 and gp210 persist after orthotopic liver transplantation in patients with primary biliary cirrhosis．J Hepatol，1998，28:824-828．

11 Muratori P，Muratori L，Gershwin ME，et al．＇True＇antimitochondrial antibody-negative primary biliary cirrhosis，low sensitivity of the routine assays，or both．Clin Exp Immunol，2004，135:154-158．