口腔黏膜白斑上皮組織中凋亡相關蛋白Bax的表達研究

滿一 沈國華 鐘良軍

白斑是公認的最常見的癌前病變之一，上皮過度增生或不典型增殖是其特點，是上皮細胞數量由單純增加向細胞質量癌變轉化的中間階段，在這個轉變過程中不僅有細胞的過度增殖，同時還存在細胞凋亡異常，凋亡失控在細胞惡變的起始過程發揮作用［1，2］，近年來Bcl-2凋亡家族中的Bax蛋白在細胞惡性轉化早期階段中的抑癌作用受到重視［3］，但此類研究報道筆者較少見。本研究通過觀察分析口腔白斑中Bax蛋白的表達狀況，探討口腔黏膜上皮惡變轉化中Bcl-2蛋白生物學行為，有助于臨床早期診斷和防治。

1 材料與方法

1．1 材料 選擇2007年4月至2009年6月中國石油天然氣集團公司中心醫院保存的的石蠟切片54例，其中正常口腔黏膜25例，白斑29例;所有檢材診斷和組織學均依據WHO標準，由同1名經驗豐富的病理學專家完成。

1．2 試劑 所有試劑均購自福州邁新生物技術有限公司。Bax為即用型鼠抗人單克隆抗體，SP復合物MaxVisionTM為快捷即用型。DAB顯色試劑盒為鏈霉親和素-辣根過氧化物酶(HPR)免疫組化染色EnVision系統，適用于鏈霉素-過氧化物酶免疫組織化學染色方法(streptavidin-peroxidase，SP)。

1．3 實驗方法 采用免疫組化SP法染色檢測細胞凋亡與增值狀況。所有組織切片經10%甲醛固定、常規脫蠟、透明、浸蠟、石蠟包埋。5 μm連續切片，固定于經多聚賴氨酸處理的載玻片上，常規組織切片脫蠟入水;微波加熱10 min暴露抗原;過氧化物酶溶液阻斷內源性過氧化物酶的活性，PBS水沖洗，鼠抗人即用型Bax抗體37℃孵育60 min，加入SP復合物HRPMarVisionTM，30℃孵育60 min;加入SP復合物HPR，4℃過夜;DAB緩沖液、DAB底物、DAB色原順序加入、混勻成DAB顯色液滴定組織切片，室溫下顯色10 min，顯色后蘇木素復染，常規脫水，二甲苯透明，封片。以PBS(0．01 mol/L，pH值 7．4)代替一抗為陰性對照，胃癌陽性染色切片為Bax的陽性對照(福州邁新生物技術公司提供)。

1．4 陽性判斷標準 采用HM2A8-2000高清晰度彩色醫學圖文分析系統，每例每張切片各隨機選取2～5個不重復、不重疊400倍高清視野，細胞質和細胞核染成棕色或棕紅色顆粒或彌漫成片狀為Bax的陽性表達。計數切片中1 000個上皮基底細胞中的陽性細胞數。參照文獻［2］標準，將Bax定級為:陽性反應為棕色到棕紅色顆粒或片狀彌散定位于胞漿，高倍鏡下計數:標本中無陽性細胞為0分，＜25%為1分;26～50%為2分;50%以上為3分，最后求其平均數。染色強度以棕色為1分;深棕色為2分;棕紅色為3分。兩者相乘，0分為陰性(－);1～3分為弱陽性(+);4～6分為中等陽性(++);7～9分為(+++)。計算凋亡指數(apoptosis index，PI)=凋亡細胞數/視野內細胞總數×100%。

1．5 統計學分析 應用SPSS 11．5統計軟件，病變組織與對照組中陽性表達率以及各種臨床指標中的表達率的的的差異采用χ2檢驗;樣本數＜40，癌前病變Bcl-2、Bax陽性表達率之間的相關性，白斑、扁平苔蘚之間的bcl-2、bax陽性表達率的差異采用Fisher精確概率法單因素相關分析，P＜0．05為差異有統計學意義。

2 結果

本研究的檢材組織類型涵蓋了口腔黏膜癌前病變發展所經歷幾個階段:正常上皮組織、單純性增生、不典型增生，最終發展為原位癌。

2．1 Bax蛋白表達定位 正常口腔黏膜上皮組織的陽性細胞主要分布在角化層和粒層，點狀散在型分布為主;單純增生組織中的陽性細胞多位于上皮棘層，部分基底層也見陽性反應性，周圍型分布為主;而不典型增生的上皮組織中以基底層陽性染色居多，主要定位于基底細胞胞質中，個別病例在胞核中也有表達，貫穿上皮全層，多數局灶性分布。Bax在各種上皮組織中的表達情況見表1。見表1、圖1～4。

表1 Bax蛋白在口腔正常黏膜、白斑上皮細胞中的表達 例

2．2 Bax蛋白表達強度 在正常口腔黏膜上皮組織中的Bax陽性細胞主要分布在角化層和粒層，但染色較淡，呈黃棕色，陽性表達率40．00%。上皮單純增生Bax陽性細胞染色強度加深，陽性細胞在上皮全層均可見，棕色和棕紅色顆粒、棕紅色顆粒，彌散分布，隨著增殖程度的增加，隨著上皮異常增生程度的加重，Bax表達逐漸增強，不典型增生上皮中分布最廣，貫穿上皮全層，整體染色強度也增強，以基底層中細胞質著色最深。Bax在在各種上皮組織中的表達情況見圖1～4。

圖1 單純增生中Bax的表達與分布(SP×100)

圖2 不典型增生中Bax的表達與分布(SP×100)

圖3 正常口腔黏膜上皮Bax表達與分布(SP×100)

2．3 Bax蛋白表達形式 (1)彌散型:組織內多數上皮細胞全層都有陽性表達;(2)周圍型:主要是在組織周邊的基底層細胞有陽性表達;(3)局灶型:上皮基底層、棘層、顆粒層內有2～6個陽性細胞組成的局灶。

3 討論

Bax蛋白是在白細胞基因文庫中發現的21 kD Bcl-2同源蛋白，因 RNA 剪方式的不同編碼 3種蛋白:Baxα、Baxβ、Baxγ。其中Baxα為跨膜蛋白，可與Bcl-2α結合異二聚體Bcl-2/Bax，或形成同種二聚體Bax/Bax，細胞凋亡的調節嚴格依賴于二者的化學計量。

Bax蛋白免疫組化染色統計結果分析:25例正常口腔黏膜有10例出現了Bax陽性表達，主要分布在角化層、粒層等基底上層，弱染色染色為主;23例上皮單純增生陽性細胞19例，陽性染色多位于上皮棘層、顆粒層，部分基底層也見陽性反應細胞，分布形式上以周圍型為表現特征，染色強度加深;不典型增生上皮增殖中陽性細胞染色強度深，以基底層陽性染色居多。無論單純增生還是不典型增生白斑組織中的Bax蛋白均顯過度表達，顯著高于正常口腔黏膜，但白斑各時期上皮組織之間的Bax蛋白陽性細胞表達率差異無統計學意義(P＞0．05)。

正常口腔黏膜上Bax蛋白陽性細胞位于基底上層，并且呈點狀散在分布，這符合黏膜上皮細胞分裂起源于基底層并逐漸向角化層移行成熟、衰老、凋亡的生理特征。而當上皮出現異常增生時，特別不典型增生時，Bax蛋白的表達隨著增生強度改變而強化，強陽性染色細胞大多集中在上皮基底層，這種Bax蛋白表達隨著上皮增生強度改變而發生的波動提示機體為了抑制過度生長的細胞群體而采取了自穩定機制。文獻報道，鼻咽癌組織中的Bax蛋白表達較慢性鼻咽炎組織的免疫反應明顯減弱，鼻咽癌中促凋亡基因受到抑制［4］。Baldve等［5］研究發現鱗癌中的Bcl-2蛋白免疫反應強烈，Bcl-2蛋白具有拮抗Bax蛋白作用，在鱗癌階段Bax蛋白表達降低。由此可見，當增生性質的改變時，若細胞獲得惡性表型，Bax蛋白可能失去作用或部分失去作用，腫瘤細胞自發的凋亡可能不再增加，細胞增殖加快。因此，在上皮細胞惡性轉化階段，Bax蛋白表達的異常增高是白斑惡變的早期階段自我免疫反應，體現了機體為抑制過度生長的細胞群體，新生細胞開始啟動了細胞自穩定機制，試圖通過Bax/Bax蛋白表達的強化，促進異常增殖細胞的凋亡，維持細胞數目的穩定，細胞凋亡能除去一些有基因突變的細胞，阻止惡性轉錄，對腫瘤的生長產生副調控作用，使腫瘤發生的時間延遲。在不典型增生后期，則是細胞惡性轉化加速階段，通過Bax蛋白表達強化加速一些分裂周期短、增殖快，具有顯著惡變表型的異質細胞凋亡。另一方面，Bax蛋白對分裂周期長、增殖慢但具有高侵襲力、尚處在潛伏期的腫瘤細胞的免疫麻痹，喪失清除能力，維持潛在腫瘤細胞增殖率，導致腫瘤細胞生存周期過長，腫瘤細胞聚集造成細胞爆發式惡變，其保留的惡性細胞具有惡性程度高、侵襲力強、預后差。基因敲除實驗也說明，細胞凋亡抑制因子如Bcl-2，可以作為癌基因，或者說細胞是凋亡的促進因子如Bax，可以作為腫瘤抑制因子，如果敲除了具有促凋亡活性基因的大鼠腫瘤的發病率升高，則提示這個基因具有抑癌功能［6］。關于細胞數目自穩定啟動機制，Adams［6］認為除 Bax、Bcl-2 和 Bak，在 Bcl-2 凋亡蛋白家族中還有一個單BH3結構域蛋白，單BH3結構域蛋白Bim、Bmf能夠與線粒體膜外的抗凋亡Bcl-2家族蛋白相互作用。其活性通過轉錄誘導、翻譯后磷酸化、細胞骨架扣押等機制調節，從而結合并拮抗抗凋亡的Bcl-2家族蛋白來誘導細胞凋亡［7］，當接到凋亡信號后，Bax與Bak在線粒體外膜聚集，形成允許細胞色素C通過的通道。在正常細胞中，Bim、Bmf被分別扣押在微管和肌球蛋白而保持無活性狀態，caspase8可以裂解激活Bid，磷酸化可以調節Bax的活性。

在細胞惡性轉化中，不典型增生的Bax蛋白陽性率高于單純增生，而細胞獲得惡性表型，促凋亡基因受到抑制，癌細胞的凋亡受阻，可能是腫瘤發生、發展的一個重要因素，說明細胞惡變發生過程中存在促凋亡與凋亡抑制的相互傾軋傾向［8］。以往的研究偏重于細胞增殖在腫瘤形成中的作用，實際上細胞凋亡和增殖的平衡是決定細胞最終表型的重要因素。從細胞凋亡的機制出發，通過誘導細胞凋亡的研究，對抓住有效治療時期，減少后期惡變的可能性或消除化療藥物的不良反應，對臨床檢測疾病的轉歸，預防癌變的發生有指導意義。

1 Gottschalk AR，Boise LH．Bcl-xL and Bcl-2 repress a common pathway of cell death．J Exp Med，1994，91:7350-7354．

2 Schimmer AD，Welsh K，Pinilla C，et al．Small-molecule antagonisys of apoptosis suppressor exhibit broad anti-tumor activity．Vancer cell，2004，5:25-35．

3 Eischen CM，Roussel MF，Korsmeyer SJ，et al．Bax loss impairs Mycinuced apoptossis and circumvents the selection of p53 mutations during Myc-mediated lymphomagenesis．Mol Cell Biol，2001，21:7653-7662．

4 王茂鑫．鼻咽癌組織中凋亡相關基因蛋白表達及意義．貴陽醫學院學報，2005，6:214-216．

5 Baldve B，Francis WS，Bryan Whitatker，et al．Immunohistochemical evalution of bcl-2 oncoprotein in oral dysplasia and carcinoma．Oral Surg O-ral Med Pathol，1988，85:692-697．

6 Adams JM．Ways of dying:multiple pathways to apoptosis．Genes Dev，2003，17:2481-2495．

7 Villunger A，Michalak EM，Coultas L，et al．P53-and drug-induced apoptotic responses mediated by BH3-only proteins puma and noxa．Science，2003，302:1036-1038．

8 Yin C，Knudson CM，Korsmeyer SJ，et al．Bax suppression tumorigensis and stmulates apoptosis in vivo．Nature，1997，385:637-640．