高原鼠兔血紅素氧合酶1的基因克隆及序列分析*

杜 楊， 楊應忠， 馬 燕， 曹雪峰， 格日力

近年來，血紅素氧合酶(heme oxygenase，HO)在氧化應激損傷中的細胞保護作用越來越多地受到國內外學者的廣泛關注。HO是血紅素代謝的起始酶和限速酶，幾乎分布于所有的組織和器官，主要存在于滑面內質網中。已證實在人類和哺乳動物體內，共發現3種 HO的同工酶，分別為 HO-1、HO-2和HO-3［1］。它們在膽紅素形成過程中能降解血紅素，產生等摩爾的膽綠素、一氧化碳(carbon monoxide，CO)和鐵(Fe2+)。膽綠素在膽綠素還原酶作用下迅速生成膽紅素。近年來研究發現，許多因素可引起誘導型HO(HO-1)的表達增加［2］，HO-1及血紅素降解產物膽綠素、膽紅素、CO和鐵離子參與機體許多生理和病理過程，發揮著積極重要的調節作用。HO-1在氧化應激狀態下，通過抑制炎性因子的產生、直接的抗氧化應激、衰減炎癥應答，從而達到對細胞的保護［3－5］。CO作為HO-1降解血紅素產生的重要產物之一，與細胞內另一重要信息調節分子一氧化氮(nitric oxide，NO)具有類似的生物學功能，二者具有相似的信號轉導途徑，NO的一些生物效應參與了HO-1的誘導和CO生成，在某些情況下HO-1的活性也調節著NO的產生。

高原鼠兔(plateau pika/Ochotona curzoniae)是青藏高原特有的小型哺乳動物，為兔形目、鼠兔科、鼠兔屬［6］，世代生活在海拔3 200～4 700 m的低氧、極寒草原，在其數代的自然選擇、進化過程中已形成自己獨特的高效率的能量代謝和氧傳遞利用機制，使其可以耐受低氧、低溫的高原環境。

本中心以往的研究表明，對于復雜惡劣的高原環境，高原鼠兔一方面通過對器官、組織、結構以及功能水平的變化調節協助其適應低氧環境，另一方面從分子水平對某些低氧相關基因的特異性突變及其表達水平的調控來適應低氧環境;高原鼠兔血紅蛋白、肌紅蛋白、低氧誘導因子、Na+，K+-ATP酶與平原地區動物核苷酸和氨基酸序列相比較發現，高原鼠兔與其比較存在多個差異位點，其突變位點與高原鼠兔高原適應的關系值得進一步研究［7－8］。對高原鼠兔的肺、骨骼肌的生理功能的研究表明，高原鼠兔通過維持細胞內正常水平的NO，進而降低肺血管的張力，抑制平滑肌增殖，調節血流量，減少肺血管內皮細胞損傷，保證它在長期低氧暴露下的機體防御功能［9］。以白肌纖維為主的高效儲氧的骨骼肌，對其適應高原的生存環境也具有重大意義［10］。因此，為了對高原鼠兔低氧適應的分子機制進行深入研究，本研究克隆并分析高原鼠兔HO-1基因cDNA序列。

材料和方法

1 動物

2011年7月于青海省天俊縣木里鎮(海拔約4 062 m，東經96°49'～99°41'，北緯 36°53'～ 48°39')捕捉高原鼠兔13只，平均體重200 g，25%烏拉坦腹腔注射麻醉，解剖后取肝組織并置于液氮中，低溫保存備用。

2 主要試劑

動物組織總RNA提取試劑盒、cDNA第1鏈合成試劑盒、DNA分子量標準、普通DNA產物純化試劑盒、2×Taq PCR MasterMix聚合酶購自天根公司;TaKaRa 3’Full RACE試劑盒、RNase H、T4 RNA連接酶購自大連寶生物公司。其它試劑均為國產或進口產品。

3 主要方法

3.1 引物設計與合成 通過GenBank中公布的兔(Oryctolagus cuniculus XM_002711415)、人(Homo sapiens NM_002133.2)、牛(Bos taurus M_002133.2)、小鼠(Mus musculus NM_010442.2)、大鼠(Rattus norvegicus NM_012580.2)等哺乳動物物種的HO-1的cDNA序列，根據其同源性，利用Primer 5.0軟件和DNAMAN 6.0軟件結合鼠兔與以上各物種間HO-1比對得到的相對保守區來設計擴增引物，引物名稱及序列見表1。引物由上海英濰捷基有限公司合成，引物子液工作濃度10 μm。

表1 HO-1引物序列Table 1.The primer sequences of HO-1

3.2 總RNA的提取及鑒定 采用RNA提取試劑盒提取高原鼠兔肝組織中的總RNA，并用分光光度計和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的純度及濃度，RNA檢測符合標準后置于－80℃冰箱保存備用。

3.3 RT-PCR擴增 根據cDNA第1鏈合成試劑盒，5 μg 總 RNA，2 μL Oligo(dT)或 2 μL Random 或2 μL 基因特異性引物，2 μL dNTP，補 RNase-free 水至14.5 μL，70 ℃加熱5 min后迅速冰上冷卻2 min，簡短離心后加入 4 μL 5 × First-Strand Buffer，0.5 μL RNasin，最后加入1 μL M-MLV，用移液器混勻，將上體系25℃溫浴10 min，42℃溫浴50 min，95℃加熱5 min終止反應，冷凍保存。PCR的反應體系:2×Taq PCR MasterMix聚合酶25 μL，上、下游引物各1 μL(10 μmol/L)及 cDNA 模板 2 μL，加雙蒸水補足到50 μL。PCR反應條件為:95℃預變性2 min，96℃ 10 s，退火30 s，72 ℃ 30 s，共35個循環(各引物退火溫度和循環次數見表1)，72℃ 10 min，4℃保存。

3.4 3’末端的PCR擴增 根據簡并引物2F-2R擴增測序結果設計內、外側特異性引物(PK-HO1-3INNER和PK-HO1-3OUTER，見表1)，與大連寶生物的TaKaRa 3’-Full RACE試劑盒提供的通用接頭引物進行PCR擴增，即采用套式PCR技術:使用上游外側特異性引物和3’RACE outer primer進行第1步PCR反應。如果第1步PCR反應未能得到目的產物，在使用上游內側特異性引物(PK-HO1-3INNER，見表1)和3’RACE inner primer進行第2步PCR反應。

3.5 5’末端的PCR擴增 以cDNA為模板，根據3’末端測序結果，另設計2對基因特異性引物S1、A1、S2、A2以及末端磷酸化的反轉錄產物 PK-5’RT。首先合成cDNA第1鏈，即用末端磷酸化的反轉錄引物在反轉錄酶(reverse transcriptase，RT)催化作用下對總RNA進行反轉錄，再使用水解酶RNase H將Hybrid DNA-RNA中的RNA鏈分解，然后采用連接酶T4 RNA Ligase將單鏈cDNA進行環化形成首尾連接物。進行套式PCR擴增時，第1步擴增采用基因特異性引物A1和S1，第2步PCR擴增以第1輪PCR產物為模板，采用基因特異性引物A2和S2擴增出未知mRNA的5’端，套式PCR擴增方法、體系、條件等與普通PCR擴增一致。

3.6 PCR產物的回收及序列測定 PCR擴增產物根據預測片段大小的差異，采用1.5%和2.0%瓊脂糖凝膠電泳分離出特異性目的片段。用普通DNA產物純化試劑盒按說明純化DNA片段，回收純化的DNA片段采用正、反向測序，測序由上海英濰捷基貿易有限公司完成。

4 數據處理與分析

將各序列測序結果進行拼接，在NCBI數據庫的BLAST工具欄中對測序結果進行比對分析;NCBI數據庫的ORF Finder工具及Sequencher軟件對開放閱讀框架進行預測，DNAMAN 6.0軟件可進行序列的相似性分析，Bioedi軟件將核苷酸序列翻譯成相對應的氨基酸序列，MEGA 5.0構建系統進化樹。

結 果

1 總RNA的提取

RNA提取試劑盒提取的高原鼠兔肝臟組織總RNA，測定A260/A280為1.83;瓊脂糖凝膠電泳結果可見清晰完整的18S和28S條帶和較淡的5S條帶，提示所提取總RNA純度較高且未降解，可用作逆轉錄模板，用于下一步RT-PCR反應。

2 PCR擴增結果

合成的高原鼠兔HO-1基因cDNA在PCR儀里進行擴增，擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳，然后在凝膠電泳成像儀紫外燈下觀察，得到的特異目的條帶與預期片段大小一致，見圖1。回收純化PCR產物后送測序。

Figure 1.Agarose gel electrophoresis of RT-PCR-amplified Ochotona curzoniae HO-1 gene fragments.A:primer 2F-2R-amplified gene fragment;B:primer 3’RACE-amplified gene fragment;C:primer S2-A2-amplified gene fragment;D:primer F2-R2-amplified gene fragment;M1:5 000 bp marker;M2:2 000 bp marker.圖1 高原鼠兔HO-1基因RT-PCR擴增產物片段凝膠電泳

3 測序結果及序列分析

3.1 cDNA序列拼接和開放閱讀框的預測 對測序結果進行拼接，所測序列得到cDNA全長序列，長度1 466 bp(GenBank登錄號為JX035934)。軟件預測得出高原鼠兔HO-1基因編碼區的核苷酸長度為873 bp，可編碼290個氨基酸，見圖2。

Figure 2.Nucleotide and deduced amino acid sequences of coding region of Ochotona curzoniae HO-1 gene.圖2 高原鼠兔HO-1基因編碼區的核苷酸序列及推導的氨基酸序列

3.2 序列相似性比較 將高原鼠兔與其它物種HO-1基因編碼區及氨基酸序列進行相似性比較，結果表明HO-1基因在不同物種間顯示出高度的保守性，這也證明了HO-1基因在各物種進化過程中仍然存在著重要的生物學聯系，見表2、3。

表2 高原鼠兔與其它物種HO-1基因編碼區及氨基酸序列相似性比較Table 2.Similarity comparison of HO-1 gene nucleotide and amino acid sequences between Ochotona curzoniae and other species

表3 高原鼠兔與其它物種間HO-1氨基酸位點的差異性分析Table 3.Difference analysis of the amino acid sites of HO-1 between Ochotona curzoniae and other species

3.3 系統進化樹構建 進一步通過用MEGA 5.0建立的系統進化樹可以看出，高原鼠兔與兔的遺傳距離最近，見圖3。

Figure 3.Phylongenetic tree based on amino sequence of HO-1 from Ochotona curzoniae and other species.The numbers above the branches are phylogenetic branch distance of HO-1 among different species.圖3 以氨基酸序列為基礎的高原鼠兔及其它物種的系統進化樹

討 論

近年來大量研究表明，HO-1及其降解血紅素產生的代謝產物具有抗炎、抗凋亡、抗增殖、調節細胞周期、維持正常微循環血流、血管重構等效應［11］，同時畢建立等［12］指出，HO-1能夠抑制細胞毒性ROS，避免DNA的損傷，脂質過氧化提示HO-1能夠產生對細胞的保護效應。而一些有限的HO-1缺陷的相關報道和HO-1缺陷的動物模型表現也證實了這一觀點(HO-1缺陷出現了發育遲緩、組織鐵沉積、貧血、淋巴結腫大、白細胞增多以及多氧化應激敏感性增強等特征表現)。HO-1提供細胞保護作用的機制尚未完全闡明，但目前可以肯定的是相關促炎因子的表達下調和抗炎因子的表達上調共同發揮著重要作用。

大量研究［13-15］發現，HO-1與許多肺疾病、心血管疾病和肝疾病有關，HO-1表達增加，缺氧性肺動脈高壓、血管重建和炎癥都將減弱;對于氧化損傷參與的疾病，HO-1在疾病的進程中對維持內環境的穩態發揮著主要作用。Yet等［16］指出，HO-1的高度表達能夠對心肌組織缺血/再灌注損傷起積極的保護作用。HO-1產生的代謝產物膽紅素與缺血性心肌功能損害的改善密切相關，產生的CO能夠降低缺血損傷造成的死亡率。一些人類學研究進一步發現，提前誘導HO-1在一定程度上能夠阻止氧化損傷，HO-1的抑制卻能加重損傷。

本實驗首次成功地獲得高原鼠兔HO-1基因編碼區的cDNA序列全長，基因序列分析結果顯示，克隆得到由873 bp組成的開放閱讀框可編碼290個氨基酸。將該序列登錄于 GenBank，登錄號為JX035934。高原鼠兔HO-1基因的編碼區序列與兔、人、牛、小鼠、大鼠、豬和馬HO-1核苷酸序列的同源性分別為89%、87%、85%、79%、84%、85%和85%，氨基酸序列相似性分別達到89%、85%、84%、80%、79%、82%和67%，顯示出高度保守性。在本研究進行的氨基酸差異性位點分析中，所比較物種的15個氨基酸差異性位點中有5個位點(第4、92、223、250和255位)可能導致各物種在調節HO-1與低氧相關因子相互作用方面產生差異，進而對高原低氧適應的調控造成重要影響。對比高原鼠兔與兔HO-1基因編碼區的序列時，我們分析發現高原鼠兔HO-1基因中第9位密碼子 TTG→ATG，第 67位密碼子CAC→CGC，第87位密碼子CCT→GCC，第194位密碼子AGC→GGG，第285位密碼子CTT→GTA;推導的氨基酸的序列也發生突變，即第9位的亮氨酸(Leu)突變為蛋氨酸(Met)，第67位的組氨酸(His)突變為精氨酸(Arg)，第87位的脯氨酸(Pro)突變為丙氨酸(Ala)，第194位的絲氨酸(Ser)突變為甘氨酸(Gly)，第285位的亮氨酸(Leu)突變為纈氨酸(Val)。從這一層面也反映出，與移居高原的同科物種比較，世居高原的鼠兔仍與其存在著結構、功能上的顯著差異，這或許是高原鼠兔對高原遺傳性適應的一種表現，也可能是其抗缺氧能力更強的原因之一，但是突變位點與高原適應相關聯的具體機制仍有待于進一步研究。系統進化方面，進化樹分析結果表明，高原鼠兔HO-1與其它動物的HO-1匯成一支，它們與高等動物的HO-1源自一個共同的根，擁有共同的祖先，但分別處于不同層次的進化分支上。高原鼠兔HO-1與兔子HO-1的上一級同屬一個進化分支，親緣關系最近，而與人、豬、牛等的遺傳距離較遠，這一結果與通常所認識的鼠兔屬于兔形目(Lagomorpha)是一致的。

高原土生動物在長期的生存中無時無刻不在對抗著低氧損傷，同時經過連續的進化，逐漸形成自己獨特的低氧適應及抗氧化應激損傷的機制，其本質就是在低氧高寒等條件下機體能夠最大限度地從器官、組織直至分子、細胞、基因各個層面上發揮細胞保護功能，保證機體完成正常的生理功能和能量代謝。近年來，HO-1應激性細胞保護效應研究成為熱點，因此，其結構和功能已成為高原低氧高寒等適應研究的重要內容［17］。

由于HO-1與細胞保護密切相關，為了更進一步地了解高原鼠兔保護細胞免受氧化應激損傷的機制，通過進一步對高原鼠兔適應高原低氧高寒相關基因的研究，對于今后更好地及早干預氧化損傷疾病的發展進程，治愈氧化損傷等引起的疾病具有重大的意義。

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