姜黃素通過抑制內質網應激和JNK通路過度活化減輕小鼠肺缺血再灌注損傷*

趙 珊， 馬迎春， 劉亞坤， 周俊輝， 郝卯林， 陳海娥， 孫 勤， 王萬鐵△

近年來隨著體外循環技術的不斷開展，肺缺血/再灌注(ischemia reperfusion，I/R)所致的嚴重肺損傷越來越受到重視。研究提示，肺I/R過程中發生的氧化應激［1］、ATP 耗竭及細胞內鈣穩態失衡［2］等因素將誘發內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)，適度的ERS有利于細胞恢復內環境穩態和維持存活，但持續或高強度的ERS則會導致細胞凋亡［3］，從而進一步加重肺I/R損傷。研究表明，干預細胞凋亡對I/R肺損傷具有一定的防治作用［4］。c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)信號通路是絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)家族中重要的通路之一，存在于多種生命活動過程中且易受多種細胞外應激因素激活并介導細胞凋亡［5］。隨著對ERS研究的深入，已證實JNK信號通路參與介導了過度ERS中引發的細胞凋亡。

姜黃素(curcumin，Cur)是中藥姜黃的有效成分，具有抗炎、抗氧化、抗肺動脈高壓、抗腫瘤等［6-7］作用。臨床研究發現，Cur在心［8］、腦［9-10］等多種重要器官的I/R損傷中發揮良好的保護作用［11］。因此我們推斷，Cur可能對治療肺I/R損傷也會有較好效果。目前的研究結果提示，Cur可能通過抑制ERS下的JNK通路發揮對肺的保護。本研究通過建立小鼠左側原位肺I/R損傷模型，以Cur對I/R模型進行干預，探討Cur能否通過抑制ERS下的JNK通路的過度活化來對抗肺I/R損傷，以期為Cur臨床治療肺I/R損傷提供實驗依據和理論基礎。

材料和方法

1 動物

SPF級雄性C57BL/6J小鼠60只，平均體重(20±2)g。由溫州醫學院實驗動物中心提供［動物使用許可證號為SYXK(浙)2010-0150］。

2 主要試劑

姜黃素(Sigma)，In Situ Cell Death Detection Kit，POD(Roche)，逆轉錄試劑盒和PCR試劑盒(Fermentas Life Science);兔抗GAPDH多克隆IgG抗體(中國杭州賢至生物科技有限公司)，葡萄糖調節蛋白78(glucose-regulated protein 78，GRP78)Ⅰ抗、JNKⅠ抗和磷酸化JNK(p-JNK)Ⅰ抗(Cell Signaling Technology)，Ⅱ抗(辣根過氧化物酶偶聯山羊抗兔IgG，北京中杉金橋生物科技有限公司)，BCA蛋白濃度測定試劑盒(中國碧云天生物技術研究所)，DAB顯色試劑盒(×20)(北京中杉金橋生物科技有限公司)，DNaseⅠ(Sigma)，其余均為市售分析純。

3 主要方法

3.1 動物模型復制 按照文獻報道的方法復制小鼠原位肺 I/R模型［12］。小鼠經腹腔注射氯胺酮(0.1 mg/g)+賽拉嗪(0.01 mg/g)進行麻醉。切開氣管，氣管插管接小動物呼吸機，呼吸機參數設置為:潮氣量0.6 mL，呼吸頻率120 min－1，吸呼比3∶2。電熱毯保溫，監測體溫。沿左胸骨斷開第2、3肋骨，打開胸腔，暴露左肺，找到左肺門并以微型動脈夾夾閉30 min，即為缺血期;之后松開動脈夾，形成再灌注期，再灌注3 h。

3.2 Cur藥物干預分組 按隨機數字表法將實驗動物分為6組，每組10只:sham組:只開胸不夾閉肺門，觀察3.5 h后處死并取左肺;I/R組:阻斷左肺門30 min，再灌注3 h，處死取左肺;I/R+DMSO組:于缺血前2 h經腹腔注射10%DMSO(20 mL/kg)，余同I/R組;I/R+Cur低、中、高劑量組:于缺血前2 h經腹腔注射不同劑量(低劑量為100 mg/kg，中劑量為150 mg/kg，高劑量為200 mg/kg)Cur溶液，余同I/R組。

3.3 肺濕干重比(wet/dry weight ratio，W/D)和總肺水含量(total lung water content，TLW)檢測 取左肺上葉組織，用生理鹽水漂洗，濾紙吸干水分，稱重為濕重;在恒溫電熱鼓風干燥箱70℃24 h烘干后稱重為干重，兩者之比為肺W/D。TLW的計算公式如下:TLW=(W－D)/D。

3.4 肺組織光鏡檢測及肺泡損傷定量評估指數(index of quantitative assessment，IQA) 檢測 按 文獻［13］，取左肺下葉約0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm 大小肺組織，經4%甲醛固定，常規石蠟包埋切片，HE染色，顯微鏡下觀察各組標本組織學改變。在400倍視野下隨機連續觀察50個視野，計數每個視野下的總肺泡數及損傷肺泡數。肺泡內含紅細胞或白細胞超過2個以上或肺泡內含有水腫滲出液的均視為損傷肺泡。把損傷肺泡數占總計肺泡數百分比的值作為IQA。

3.5 肺組織電鏡檢測 取左肺近肺門處約1 mm×1 mm×1 mm大小的肺組織若干小塊，經2.5%戊二醛前固定，再依次經1%鋨酸后固定，1%醋酸鈾塊染，酒精梯度脫水，丙酮浸透，Epon 812包埋聚合，半薄切片和超薄切片，經醋酸鈾和硝酸鉛雙重染色后，于電鏡下觀察各標本組織學改變結果。

3.6 RT-PCR檢測JNK和GRP78 mRNA表達 Trizol法抽提總RNA，測定總RNA濃度。按照逆轉錄試劑盒說明書逆轉錄合成cDNA，再按照PCR試劑盒說明書進行cDNA擴增。引物序列見表1。PCR反應條件為:95℃ 1 min;95℃ 30 s，55℃(GAPDH)/56℃(JNK)/49 ℃(GRP78)30 s，72 ℃ 30 s，循環33次;72℃ 10 min。

表1 引物序列Table 1.Sequences of the primers

3.7 Western blotting檢測 JNK、p-JNK 和 GRP78蛋白含量 將約100 mg肺組織塊置研缽中并碾碎，加800 μL單去污劑裂解液(含PMSF)于研缽中，于冰上反復碾壓使組織碾碎。取上清液，BCA法測定蛋白濃度。10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，濕式電轉移法轉移至PVDF膜，室溫下用封閉液封閉2 h后加入Ⅰ抗JNK、p-JNK、GRP78單克隆抗體及兔抗GAPDH多克隆IgG抗體(1∶1 000稀釋)，4℃反鋪法過夜。分別加入1∶500Ⅱ抗，室溫反應2 h。ECL化學發光，X射線底片曝光。

3.8 原位缺口末端標記法(TUNEL法)檢測肺組織細胞凋亡 按照試劑盒說明操作。細胞核中有棕褐色顆粒者為陽性細胞。計數5個高倍鏡(×400)下的凋亡細胞數。凋亡指數(apoptotic index，AI)=檢測到的凋亡細胞數÷5個高倍視野檢測到的細胞總數×100%。

4 統計學處理

采用SPSS 15.0統計軟件分析。數據用均數±標準差(mean±SD)表示。正態分布數據的組間均數比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)和LSD法，非正態分布數據進行Kruskal-Wallis檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 各組肺W/D、TLW和IQA的變化

與sham組相比，I/R組和I/R+DMSO組W/D、TLW及IQA均明顯升高(P＜0.01)，且I/R組和I/R+DMSO組相比，W/D、TLW和IQA無顯著差異(P＞0.05);與 I/R+DMSO組相比，I/R+Cur低、中、高劑量組W/D、TLW及IQA逐漸下降(P＜0.05或P＜0.01)，以I/R+Cur高劑量組降低明顯(P＜0.05或P ＜0.01)，見表2。

表2 各組肺組織W/D、TLW、IQA及AI的變化Table 2.Comparison of W/D，TLW，IQA and AI of lung tissues in different groups(mean±SD.n=10)

2 各組肺組織形態學變化

Sham組肺間質及肺泡完整，未見炎癥細胞浸潤，見圖1A。I/R組和I/R+DMSO組肺泡結構紊亂，肺泡壁水腫增厚或破裂，肺泡內水腫滲出或紅細胞漏出或炎癥細胞漏出，見圖1B、C(粗箭頭示炎癥浸潤，細箭頭示肺泡內水腫)。I/R+Cur低、中、高各劑量組肺泡結構相對較完整，肺泡內水腫及炎癥細胞浸潤均有不同程度減輕，以I/R+Cur高劑量組減輕最為明顯，見圖1D、E、F。

Figure 1.Morphological changes of mouse lung tissues in various groups(×200).A:sham group;B:I/R group;C:I/R+DMSO group;D:I/R+Cur(low dose)group;E:I/R+Cur(medium dose)group;F:I/R+Cur(high dose)group.圖1 各組肺組織形態學的變化

3 各組肺組織超微結構改變

由圖2A可見，sham組毛細血管內皮細胞結構正常，基底膜完整，II型肺泡上皮細胞結構完整，線粒體嵴清楚，板層小體未見改變，微絨毛無減少。I/R組和I/R+DMSO組毛細血管內皮細胞腫脹，基底膜有斷裂、不完整，線粒體腫脹，II型肺泡上皮細胞微絨毛脫落明顯，核固縮，胞漿內板層小體數量減少、排空增多，肺泡隔水腫，肺泡隔及毛細血管內炎癥細胞附壁增多，見圖2B、C(粗箭頭示板層小體，細箭頭示微絨毛)。與I/R組及I/R+DMSO組相比，隨著姜黃素劑量的逐漸增加，I/R+Cur各劑量組肺組織超微結構損傷逐漸減輕，肺泡結構和內皮細胞的超微結構清晰可辨，內皮細胞腫脹較輕，核染色質較均勻;肺泡Ⅱ型上皮細胞與鄰近結構的界限明顯，其表面微絨毛較多，基質中線粒體輕度腫脹，嵴較多，嗜鋨性板層不多，肺泡隔結締組織略增厚，以Cur高組最為明顯，見圖2D、E、F。

Figure 2.Ultrastructure changes of type II alveolar epithelial cells in different groups observed by electron microscopy(×10 000).A:sham group;B:I/R group;C:I/R+DMSO group;D:I/R+Cur(low dose)group;E:I/R+Cur(medium dose)group;F:I/R+Cur(high dose)group.圖2 各組肺組織超微結構的變化

4 各組JNK和GRP78 mRNA水平表達的變化

GRP78 mRNA在sham組中低表達，在其余所有組別中均明顯表達(P＜0.05);JNK mRNA在sham組中低表達，在I/R組、I/R+DMSO組和I/R+Cur各劑量組中均明顯表達(P＜0.05)，但隨著I/R+Cur劑量的增加，其表達量逐漸降低，以I/R+Cur高劑量組下降最為明顯(P＜0.05)，見圖3。

Figure 3.The expression levels of GAPDH，GRP78 and JNK mRNA in mouse lung tissues in various groups detected by RT-PCR.A:sham group;B:I/R group;C:I/R+DMSO group;D:I/R+Cur(low dose)group:E:I/R+Cur(medium dose)group;F:I/R+Cur(high dose)group.Mean±SD.n=10.*P＜0.05 vs sham group;▲P＜0.05 vs I/R+DMSO group.圖3 各組肺組織GRP78和JNK mRNA的表達水平

5 各組JNK、p-JNK和GRP78蛋白水平表達的變化

各組肺組織均可檢測到JNK蛋白的表達，且表達量在各組間無明顯差異。p-JNK蛋白在sham組中低表達，在I/R組、I/R+DMSO組和I/R+Cur各劑量組中均明顯表達(P＜0.05)，但隨著Cur劑量的增加，其表達量逐漸降低，以I/R+Cur高劑量組下降最為明顯(P＜0.05);GRP78蛋白在sham組中低表達，在其余所有組別中均明顯高表達(P＜0.05)，見圖4。

Figure 4.The expression levels of GAPDH，GRP78，p-JNK and JNK proteins in mouse lung tissues in various groups detected by Western blotting.A:sham group;B:I/R group;C:I/R+DMSO group;D:I/R+Cur(low dose)group:E:I/R+Cur(medium dose)group;F:I/R+Cur(high dose)group.Mean±SD.n=10.*P＜0.05 vs sham group;▲P ＜0.05 νs I/R group.圖4 Western blotting示各組肺組織GRP78和p-JNK蛋白的表達水平

6 各組肺組織細胞AI的改變

由圖5、表2可見，sham組細胞凋亡數量較少;與sham組相比，I/R組和I/R+DMSO組細胞凋亡數量明顯增多，細胞凋亡以肺血管內皮細胞和肺泡上皮細胞為主，AI亦明顯升高(P＜0.01);I/R組與I/R+DMSO組相比，AI無顯著差異(P＞0.05);與I/R組和I/R+DMSO組相比，I/R+Cur低、中、高劑量組細胞凋亡數量逐漸降低，AI亦逐漸下降(P＜0.05或P＜0.01)，以 I/R+Cur高劑量組下降最為明顯(P ＜0.01)。

Figure 5.Apoptosis of mouse lung tissues in various groups detected by TUNEL method(×400).A:sham group;B:I/R group;C:I/R+DMSO group;D:I/R+Cur(low dose)group;E:I/R+Cur(medium dose)group;F:I/R+Cur(high dose)group.圖5 各組肺組織細胞凋亡的情況

7 相關性分析結果

AI與 W/D、TLW、IQA、JNK mRNA 和 p-JNK 蛋白之間呈明顯正相關關系(r分別為0.787、0.768、0.898、0.873 和 0.892，均 P ＜ 0.01，n=60)，與GRP78 mRNA和蛋白之間呈明顯負相關關系(r分別為－0.306和 －0.341，均 P ＜0.05，n=60)。

討 論

本研究觀察到sham組肺組織少量細胞凋亡，I/R組和I/R+DMSO組出現大量的細胞凋亡，同時肺組織受損程度的敏感指標W/D、TLW和IQA均明顯升高，光鏡、電鏡顯示肺組織結構明顯損傷，且肺細胞AI與W/D、TLW和IQA呈正相關關系，提示細胞凋亡參與了肺I/R損傷的發生。經Cur干預后，肺組織細胞AI、W/D、TLW和IQA降低，肺組織結構損傷減輕，表明Cur可能通過減輕細胞凋亡而治療肺I/R損傷，保護肺組織。

缺血缺氧、葡萄糖/營養物質匱乏、ATP耗竭、氧化應激及Ca2+穩態破壞等因素均可引起ERS［14］，研究已證實，持續過強的ERS將引起ERS相關細胞凋亡，從而引起組織損傷。ERS需3種內質網跨膜蛋白——蛋白激酶R樣內質網激酶(protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase，PERK)、肌醇需求酶1(inositol-requiring enzyme 1，Ire1)和活化轉錄因子6(activating transcription factor 6，ATF6)介導，正常情況下，這3種蛋白的內質網腔內側都與GRP78結合而處于無活性狀態。ERS發生時，GRP78即與這3種蛋白質解離，因此GRP78的急速上調被認為是ERS最敏感的標志［15］。解離的GRP78與未折疊/錯誤折疊蛋白質結合緩解內質網內未折疊蛋白負荷發揮保護作用。本實驗結果顯示，GRP78 mRNA和蛋白表達量在sham組很低，而肺I/R后表達明顯上調，說明肺I/R誘導了過度ERS的發生，同時GRP78發揮著積極的保護作用。

MAPKs是存在于細胞漿內的一類具有絲氨酸/蘇氨酸磷酸化位點的蛋白激酶家族，參與細胞生長、增殖、分化等多種生理過程，并能將多種細胞外信號通過磷酸化傳遞到細胞核中，因此MAPKs信號通路是細胞外與細胞內信號轉導的交匯點，是細胞內重要的信號轉導系統。JNK信號轉導通路是MAPKs信號通路中重要的通路之一，在多種生理、病理的程序性細胞死亡過程中起重要的調控作用。并且JNK通路與應激誘導型凋亡有關，可被多種細胞外應激(如缺血缺氧、細胞因子、應激等)激活而引起細胞凋亡，進而損傷組織。許多學者發現多種臟器I/R后，存在JNK的過度激活，且抑制JNK可改善I/R損傷。因此，深入探討JNK在臟器I/R中的作用對于治療肺I/R損傷具有重要意義。嚴重ERS時，活化的Ire1與TNF受體相關因子1(TNF receptor-associated factor 1，TRAF1)相連，其復合物募集凋亡信號調節激酶1(apoptosis signal-regulating kinase 1，ASK1)將激活JNK通路，引起細胞凋亡［16］。研究表明，乳鼠心肌細胞缺氧/復氧和心肌I/R中，心肌組織細胞再灌注損傷與GPR78和JNK表達增高有關［17］，缺血后處理通過抑制JNK通路對再灌注心肌發揮保護作用［18］。本實驗觀察到，肺I/R后JNK迅速活化，JNK mRNA和p-JNK蛋白表達明顯上調。給予Cur預處理后，JNK mRNA表達和p-JNK蛋白表達呈劑量依賴性下調，且其表達量與細胞AI呈明顯正相關關系。上述結果提示抑制JNK凋亡途徑可能是減輕肺I/R損傷的途徑之一;Cur可能通過抑制ERS中JNK信號轉導通路的過度活化來拮抗肺I/R損傷。

［1］ Klass O，Fischer UM，Antonyan A，et al.Pneumocyte apoptosis induction during cardiopulmonary bypass:effective prevention by radical scavenging using N-acetylcysteine［J］.J Invest Surg，2007，20(6):349-356.

［2］ Page AB，Owen CR，Kumar R，et al.Persistent eIF2α(P)is colocalized with cytoplasmic cytochrome c in vulnerable hippocampal neurons after 4 hours of reperfusion following 10-minute complete brain ischemia［J］.Acta Neuropathol，2003，106(1):8-16.

［3］ Xu C，Bailly-Maitre B，Reed JC.Endoplasmic reticulum stress:cell life and death decisions［J］.J Clin Invest，2005，115(10):2656-2664.

［4］ Quadri SM，Segall L，de Perrot M，et al.Caspase inhibition improves ischemia-reperfusion injury after lung transplantation［J］.Am J Transplant，2005，5(2):292-299.

［5］ Bogoyevitch MA，Ngoei KR，Zhao TT，et al.c-Jun N-terminal kinase(JNK)signaling:recent advances and challenges［J］.Biochim Biophys Acta，2010，1804(3):463-475.

［6］ 孫曉東，劉杏娥.姜黃素通過抑制Ras-ERK和Shh-GLI1信號誘導胰腺癌細胞凋亡［J］.中國病理生理雜志，2012，28(6):996-1000.

［7］ 曠焱平，陳 墾，何博華，等.光敏化促進姜黃素誘導人胃癌MGC-803細胞凋亡［J］.中國病理生理雜志，2012，28(7):1247-1252.

［8］ Yeh CH，Lin YM，Wu YC，et al.Inhibition of NF-κB activation can attenuate ischemia reperfusion-induced contractility impairment via decreasing cardiomyocytic proinflammatory gene up-regulation and matrix metalloproteinase expression［J］.J Cardiovasc Pharmacol，2005，45(4):301-309.

［9］ Jiang J，Wang W，Sun YJ，et al.Neuro protective effect of curcumin on focal cerebral ischemic rats by preventing blood-brain barrier damage［J］.Eur J Pharmacol，2007，561(1-3):54-62.

［10］ 行妍妍，汪軍兵，謝 賽，等.姜黃素對放線菌素 D/TNF-α誘導的PC12細胞和大鼠海馬神經元損傷的影響［J］.中國病理生理雜志，2012，28(10):1746-1750.

［11］Yucel AF，Kanter M，Pergel A，et al.The role of curcumin on intestinal oxidative stress，cell proliferation and apoptosis after ischemia/reperfusion injury in rats［J］.J Mol Histol，2011，42(6):579-587.

［12］ Zanotti G，Casiraghi M，Abano JB，et al.Novel critical role of Toll-like receptor 4 in lung ischemia-reperfusion injury and edema［J］.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2009，297(1):L52-L63.

［13］邱曉曉，宋張娟，戴雍月，等.三七總皂苷對肺缺血/再灌注損傷時細胞凋亡及c-Jun氨基末端激酶的影響［J］.生理學報，2012，64(2):135-141.

［14］ Pahl HL.Signal transduction from the endoplasmic reticulum the cell nucleus［J］.Physiol Rev，1999，79(3):683-701.

［15］張海燕，劉寶琴，鄧娓娓，等.GRP78在蛋白酶體抑制劑誘導甲狀腺癌細胞凋亡中的作用［J］.中華腫瘤防治雜志，2009，16(18):1379-1382.

［16］ Zhang C，Kawauchi J，Adachi MT，et al.Activation of JNK and transcriptional repressor ATF3/LRF1 through the IRE1/TRAF2 pathway is implicated in human vascular endothelial cell death by homocysteine［J］.Biochem Biophys Res Commun，2001，289(3):718-724.

［17］ Qi X，Vallentin A，Churchill E，et al.δPKC participates in the endoplasmic reticulum stress-induced response in cultured cardiac myocytes and ischemic heart［J］.J Mol Cell Cardiol，2007，43(4):420-428.

［18］ Liu XH，Zhang ZY，Sun S，et al.Ischemic postconditioning protects myocardium from ischemia/reperfusion injury through attenuating endoplasmic reticulum stress［J］.Shock，2008，30(4):422-427.