SFRP5基因甲基化通過激活Wnt/β-catenin通路調節白血病細胞MDR1/P-gp的表達*

王慧涵， 胡 榮， 李迎春， 趙成海， 楊 威， 廖愛軍， 劉卓剛

分泌型卷曲相關蛋白5(secreted frizzled-related protein 5，SFRP5)是分泌型糖蛋白家族成員之一，結構上與Wnt信號通路的特異性受體卷曲蛋白(Fz)受體極為相似，具有同源的配體抑制區，通過競爭性抑制Fz受體從而抑制 Wnt的活動［1］。有研究顯示在白血病細胞中存在SFRP5基因啟動子區域甲基化，導致SFRP5蛋白表達缺失或下調［2］，但這種SFRP5基因甲基化在白血病發生發展中的作用尚不明確。本文從白血病多藥耐藥的角度，研究SFRP5基因甲基化對白血病細胞多藥耐藥1(multidrug resistance 1，MDR1)基因及其編碼的P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)表達的調節作用并探索其可能的信號通路。

材料和方法

1 材料

2011年6月至2011年12月，中國醫科大學附屬盛京醫院血液科診斷(WHO診斷標準)的12例急性白血病患者(L1～L12)骨髓單個核細胞作為標本。12例患者的疾病類型為:急性淋巴細胞白血病2例(L1和 L9);急性髓系白血病 7 例(L3、L4、L6、L8、L10、L11和L12);慢性髓系白血病2例(L2和L5)。人白血病細胞系HL-60來自中國醫科大學附屬盛京醫院血液科留存;人白血病細胞系KG1a來自中國醫學科學院血液病研究所;人淋巴瘤白血病細胞系Raji和人白血病細胞系U937細胞來自上海復旦大學賈立軍教授惠贈。

2 主要試劑

AxyPrep基因組DNA小量試劑盒及MethylCodeTMBisulfite Conversion Kit購自Invitrogen;Zymo-TagTMDNA Polymerase及EZ DNA Methylation-Gold Kit購自 Zymo Research;5-氮雜-2'-脫氧胞嘧啶(5-aza-2'-deoxycytidine，DAC)購自 Sigma;SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒、Tag DNA聚合酶和M-MLV逆轉錄酶均購自TaKaRa;非磷酸化β-catenin(nonphosphorylated β-catenin，NP-β-catenin)單抗、β-actin單抗和P-gp單抗購自Santa Cruz;引物由Invitrogen公司設計及合成，見表1。

3 主要方法

3.1 甲基化特異性PCR(methylation-specific PCR，MSP) 用AxyPrep基因組DNA小量試劑盒提取基因組 DNA。用 MethylCodeTMBisulfite Conversion Kit試劑盒對基因組DNA進行亞硫酸氫鈉處理。以處理后的DNA為模板，MSP檢測SFRP5基因甲基化。PCR擴增體系20 μL:其中修飾后的 DNA 20 ng，10 μmol/L 上、下游引物各 0.4 μL，2 × Reaction Buffer 10 μL，dNTP Mix 0.2 μL，ZymoTagTMDNA Polymerase(5 ×106U/L)0.16 μL，滅菌 ddH2O 加至總體積20 μL。PCR擴增條件:95℃ 10 min;94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 40 s，40個循環;72℃ 10 min。用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物。

表1 引物序列Table 1.Sequences of the primers

3.2 Western blotting 檢測非磷酸 化 β-catenin、SFRP5及P-gp蛋白的表達 收集細胞，PBS洗2遍，每107個細胞加1 mL預冷的RIPA裂解液，混勻，冰上振蕩30 min，4 ℃、12 000 r/min離心 30 min，收上清，BCA方法測蛋白濃度。取50 μg蛋白樣品加入上樣緩沖液，100℃煮沸5 min，用SDS-PAGE分離，將蛋白轉移到硝酸纖維素濾膜上。將硝酸纖維素濾膜加入含有5%脫脂奶粉的封閉液中，4℃搖床孵育過夜，加入兔抗人非磷酸化β-catenin、兔抗人SFRP5及兔抗人P-gpⅠ抗，4℃搖床孵育過夜。除去Ⅰ抗，加入鼠抗兔Ⅱ抗，室溫下搖床孵育2 h，除去Ⅱ抗。加顯色劑，在X射線膠片曝光成像并分析。

3.3 RT-PCR檢測MDR1 mRNA的表達 用Trizol提取細胞RNA，逆轉錄為cDNA。RT-PCR擴增體系25 μL:10 × Buffer 2.5 μL，dNTP(10 mmol/L)0.5 μL，cDNA 1 μL，上、下游引物(10 mmol/L)各 0.5 μL，Tag DNA 聚合酶 (5 × 106U/L)0.5 μL，滅菌ddH2O 19.5 μL。PCR 擴增條件:94 ℃ 5 min;94 ℃1 min，55℃ 30 s，72℃ 50 s，共30個循環;72℃ 10 min。擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳，分離目的條帶和內參照。

3.4 Real-time PCR定量檢測DAC處理前后MDR1 mRNA的表達 應用SYBR? Premix Ex TaqTM試劑盒。PCR擴增體系20 μL:SYBR? Premix Ex TaqTM(2 × )10.0 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各 0.4 μL，ROX Reference Dye II(50 × )0.4 μL，cDNA 2.0 μL，滅菌 ddH2O 6.8 μL。PCR 擴增條件:95 ℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 35 s，共40個循環。各組設立3個平行孔，反應結束后，設定閾值，軟件輸出CT值。

4 統計學處理

使用SPSS 13.0統計軟件進行統計學處理，數據用均數±標準差(mean±SD)表示，多組間比較用單因素方差分析(ANOVA)，兩組之間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 SFRP5基因在白血病患者及白血病細胞系中的甲基化狀態

在12例白血病患者(L1～L12)標本中有7例(L2、L4、L5、L6、L7、L8 和 L11)發生了 SFRP5 基因甲基化，其中L5和L6發生了SFRP5基因部分甲基化。4種白血病細胞系 HL-60、Raji、U937和 KG1a中SFRP5基因均發生甲基化，見圖1。

Figure 1.SFRP5 gene promoter region methylation status detected by MSP.A:12 cases of leukemic patients;B:4 cell lines of leukemia.M:methylated;U:unmethylated.圖1 MSP方法檢測12例白血病患者標本及4種白血病細胞系中SFRP5基因甲基化狀態

2 非磷酸化β-catenin在SFRP5基因甲基化白血病患者及細胞系中的表達

由于SFRP5表達下調可能導致 Wnt/β-catenin激活，我們檢測存在SFRP5基因完全甲基化的患者標本(L2、L4、L7、L8和L11)及4種白血病細胞系中NP-β-catenin的表達狀態。檢測結果顯示在5例SFRP5完全甲基化的患者標本中，有3例(L2、L7和L8)NP-β-catenin水平高于其它2例(P＜0.05)。在4種白血病細胞系中，KG1a細胞中NP-β-catenin水平明顯高于其它3種細胞(P＜0.01)，見圖2。

Figure 2. Non-phosphorylated β-catenin(NP-β-catenin)expression in leukemic patients(A)and cell lines(B)with methylated SFRP5 gene was detected by Western blotting.Mean±SD.n=3.△△P ＜0.01 vs L4;#P ＜0.01 vs L11;＊＊P ＜0.01 vs KG1a.圖2 Western blotting檢測非磷酸化β-catenin在白血病患者標本及細胞系中的表達

3 MDR1 mRNA在白血病患者及細胞系中的表達

采用RT-PCR檢測MDR1 mRNA的表達情況，結果顯示在白血病患者標本中，存在NP-β-catenin高水平表達的3例患者(L2、L7和L8)檢出MDR1 mRNA表達。在4種細胞系中，KG1a細胞存在MDR1 mRNA表達，見圖3。

Figure 3.MDR1 mRNA expression of leukemic patients and cell lines was detected by RT-PCR.A:12 cases of leukemic patients;B:4 cell lines of leukemia.圖3 RT-PCR檢測MDR1 mRNA在白血病患者和細胞系中的表達

4 P-gp在白血病患者及細胞系中的表達

Western blotting檢測P-gp結果與MDR1 mRNA一致，即只在NP-β-catenin高水平表達的3例患者(L2、L7和L8)中檢出P-gp表達。在4種細胞系中，KG1a細胞檢出P-gp表達，見圖4。

Figure 4.P-gp expression of leukemic patients and cell lines was detected by Western blotting.A:12 cases of leukemic patients;B:4 cell lines of leukemia.圖4 Western blotting檢測P-gp在白血病患者和細胞系中的表達

5 去甲基化試劑處理后標本和細胞系中MDR1/P-gp表達的變化

使用去甲基化試劑DAC 5 μmol/L處理P-gp陽性標本 L2、L7、L8 和 KG1a，處理時間 72 h，恢復SFRP5表達。Western blotting結果顯示P-gp表達水平在SFRP5表達恢復后被下調。進一步使用realtime PCR檢測MDR1 mRNA表達，結果顯示DAC處理后MDR1 mRNA水平均顯著下降(P＜0.01)，見圖5。

討 論

SFRP5是SFRPs家族的一個分泌型蛋白，大量的研究顯示在多種腫瘤細胞中存在SFRP5基因啟動子區甲基化，并導致蛋白表達的下降［3-4］。但是SFRP5基因啟動子區甲基化及所引起的SFRP5蛋白表達缺失或下調在腫瘤中的作用尚不明確。

SFRP5作為 Wnt的抑制因子，主要通過抑制Wnt信號通路發揮作用。Wnt家族也屬于分泌型糖蛋白，是重要的細胞外信號分子家族。大量研究揭示Wnt的異常激活與多種腫瘤的發生有關［5-7］。經典的Wnt信號通路通過轉錄激活因子β-catenin激活下游靶基因發揮作用，相關的靶基因有c-myc、CCND1、MMP-7和WISPI等，這些基因參與腫瘤的形成及發展［8-10］。Lim等［11］應用大鼠腦內皮細胞及人大腦內皮細胞系hCMEC/D3作為研究對象，發現應用GSK-3抑制劑激活β-catenin通路能夠促進MDR1基因轉錄及P-gp蛋白表達，并伴隨藥物外排的增加。Flahaut等［12］報道了21例神經母細胞瘤的患者化療后存在FZD1及MDR1的過表達。應用specific micro-adaptedshorthairpinRNA(shRNAmir)介導的FZD1基因沉默后，MDR1表達明顯減少。這兩項研究將Wnt/β-catenin信號通路與腫瘤的多藥耐藥聯系在了一起，證明MDR1是β-catenin的又一個下游靶基因。但是關于Wnt的抑制因子SFRPs家族成員與MDR的關系尚無研究。

Figure 5.Effects of SFRP5 expression recovery by demethylation reagent DAC(5 μmol/L，72 h)on MDR1 mRNA and P-gp protein expression in P-gp positive specimens.A:SFRP5 expression detected by Western blotting;B:P-gp expression detected by Western blotting;C:MDR1 mRNA expression detected by real-time PCR.Mean±SD.n=3.＊＊P ＜0.01 vs DAC(－).圖5 DAC對P-gp陽性標本和細胞系中MDR1/P-gp表達的影響

Griffiths等［2］的研究提示SFRP5甲基化導致的SFRP5蛋白表達下降可能增加急性髓系白血病復發的風險。Su等［13］研究卵巢癌發現SFRP5甲基化狀態與卵巢癌對順鉑的耐藥有關，通過基因轉染恢復SFRP5表達后減弱Wnt信號通路，能夠抑制小鼠卵巢癌細胞生長、浸潤及腫瘤形成。同時SFRP5恢復表達還能夠抑制上皮－間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)，恢復 SFRP5表達能夠下調Akt2，增加卵巢癌細胞對化療的敏感性。這些研究提示了SFRP5在腫瘤復發及耐藥中可能發揮作用。

為了驗證SFRP5基因甲基化是否參與形成白血病MDR及其可能的信號通路，我們首先檢測了SFRP5甲基化的5例患者標本及4種白血病細胞系中β-catenin的活化形式——NP-β-catenin的表達狀態，結果顯示有3例患者標本的NP-β-catenin水平高于其他2例。在4種白血病細胞系中，KG1a細胞中NP-β-catenin水平明顯高于其它3種細胞系。接著發現存在NP-β-catenin高水平表達的3例患者檢出MDR1 mRNA表達。在4種細胞系中，KG1a細胞存在MDR1 mRNA表達。蛋白水平的檢測結果與mRNA水平一致，即只在NP-β-catenin高水平表達的標本中檢出P-gp表達。這個結果初步驗證了MDR1是β-catenin的下游靶基因，隨著β-catenin的激活而轉錄增加。為了進一步驗證這個結果，我們使用去甲基化試劑 DAC處理 P-gp陽性標本 L2、L7、L8和KG1a，以恢復SFRP5表達。結果顯示在SFRP5表達恢復后P-gp表達水平被下調，MDR1 mRNA水平均亦顯著下降(P＜0.01)。

因此我們認為，SFRP5基因甲基化導致蛋白表達缺失對Wnt的抑制作用減弱，引起Wnt/β-catenin信號通路被激活，β-catenin下游靶基因MDR1轉錄增加，編碼的藥物外排泵P-gp表達增加，參與腫瘤多藥耐藥的形成。當然，SFRP5基因在某些白血病細胞中存在非甲基化狀態，這些細胞的耐藥性是否有所不同尚需進一步研究。本文的結論進一步完善了白血病細胞中SFRP5基因甲基化參與腫瘤形成發展的機制，并使SFRP5及其信號通路可能作為評估白血病預后的新指標及治療多藥耐藥白血病的新靶點。

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