內質網應激誘導血管反應性降低與線粒體通透性轉換孔開放的關系*

甘稼夫， 胡 畔， 劉良明

膿毒性休克存在血管低反應性，它嚴重影響了休克的復蘇和治療。休克后血管反應性降低的發生機制目前認為主要有受體失敏、膜超極化及鈣失敏機制［1］，但針對上述機制研發的一些恢復血管反應性的藥物效果卻非常有限，提示可能還有其它調控因素參與血管低反應性的發生。基礎研究顯示內質網應激是細胞的一種自身保護性反應，但是嚴重或持續的內質網應激可通過線粒體通透性轉換孔(mi-tochondrial permeability transition pore，MPTP)的開放誘導細胞凋亡［2］，該途徑參與糖尿病、脂肪性肝炎、心臟病等多種慢性疾病的發生發展［3-4］。近年來，有關失血/創傷、休克等危急重癥存在內質網應激的報道也日益增多。內質網應激是否參與休克后血管低反應性的發生，與MPTP有何種關系，尚無報道。本實驗用大鼠盲腸結扎穿孔(cecal ligation and puncture，CLP)膿毒性休克模型，分別從整體動物模型和離體血管環水平研究了內質網應激是否可誘導血管反應性降低及其與MPTP的關系。

材料和方法

1 動物和試劑

SD大鼠體重(210±15)g，雌雄不拘，由第三軍醫大學大坪醫院野戰外科研究所實驗動物中心提供，動物合格證號(SYXK2002-032)。牛磺酸(taurine)、毒胡蘿卜素(thapsin)、環孢素 A(cyclosporin A，CsA)、抗葡萄糖調節蛋白 78(glucose-regulated protein 78，GRP78)抗體和抗CCAAT/增強子結合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein，CHOP)抗體均購自 Sigma，DMEM/F12培養基購自HyClone，胎牛血清為PAA產品，電泳相關試劑購自Promega，辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠Ⅱ抗和SuperSignal發光增強試劑盒為Pierce產品。其它試劑均為國產分析純。

2 動物模型及分組

SD大鼠45只分為正常對照組、CLP 1 h、CLP 2 h、CLP 4 h 、CLP 6 h、CLP 8 h和 CLP 6 h+牛磺酸 7組，CLP 1 h、CLP 2 h和CLP 4 h 3組每組3只，用于檢測GRP78和CHOP表達，其余4組每組9只，其中3只用于檢測GRP78和CHOP表達，6只用來檢測血管反應性。實驗前12 h禁食，自由飲水，實驗當天用戊巴比妥鈉(30～50 mg/kg，ip)麻醉，沿腹中線縱向切開腹腔，暴露并結扎盲腸，用三菱錐刺入盲腸末端造瘺，縫合關閉腹腔，右側股動脈插管并經三通管連接水銀血壓計，經插管注射肝素鈉生理鹽水(500 U/kg)抗凝，觀察血壓，平均動脈壓降至基礎水平的70%以下可界定為膿毒性休克。各組在到達相應時點后處死大鼠，取腸系膜上動脈(superior mesenteric artery，SMA)，清除周圍結締組織，用于血管反應性和GRP78及CHOP表達測定。正常組大鼠插管，不造瘺。

3 離體血管環孵育及分組

SD大鼠24只分為對照組、毒胡蘿卜素孵育組、毒胡蘿卜素+牛磺酸組和毒胡蘿卜素+CsA組，每組6只。戊巴比妥鈉麻醉后，消毒腹部皮膚，處死大鼠，取出腸系膜上動脈，無菌PBS液清洗并清除周圍結締組織，制作成2～3 mm長的血管環。將血管環放入有完全培養基的24孔板內，加入各處理藥物，在培養箱中孵育24 h:毒胡蘿卜素8 μmol/L，牛磺酸20 mmol/L，CsA 0.2 μmol/L。

4 血管反應性測定

將腸系膜上動脈制成2～3 mm血管環，掛于注有K-H液的離體器官灌流槽中，持續沖入95%O2和5%CO2混合氣體，給予初張力0.5 g，37℃恒溫孵育2 h，每20 min換液1次，待張力曲線平穩后，測定血管環對去甲腎上腺素(norepinephrine，NE)的反應性。血管環的血管反應性用NE濃度累積法測定，使所用 NE 終濃度分別為 1 ×10－9、1 ×10－8、1 ×10－7、1×10－6和1×10－5mol/L，記錄不同 NE 濃度下血管環產生的最大收縮反應(Emax)，以收縮力/血管環質量(g/mg)為量化標準，做量－效曲線，用NE的Emax和量－效曲線評價血管的反應性。

5 Western blotting檢測GRP78和CHOP

將血管組織置于預冷的蛋白裂解液［pH 7.6(mmol/L):HEPES 50，NaCl 150，EDTA 1，NP-40 1%，β-glycerophosphate 20，Na3VO41，NaF 1，benzamidine 1，para-nitrophenyphosphate 5，DTT 1，protein kinase inhibitor colktail pit］于冰浴中剪碎組織并勻漿，將上清置冰浴中凍融1 h;上清經1 000×g離心10 min(4℃)，收集上清即為胞漿總蛋白。采用Bradford法進行蛋白定量。等量樣品蛋白(每泳道120 μg)經10%SDS-PAGE凝膠電泳分離后轉移至硝酸纖維素膜，轉移完畢后用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后加入抗GRP78(1∶1 000)或抗CHOP 抗體(1∶1 000)孵育過夜，再加入辣根過氧化物酶標記II抗(1∶8 000)室溫孵育1 h，將待測的硝酸纖維素膜置于SuperSignal發光增強試劑中反應2～3 min后，迅速用塑料膜包裹硝酸纖維素膜，與X-ray膠片一同放入暗盒中曝光2～5 min，再將膠片顯影、定影，結合膜上所標記的蛋白marker位置，確定蛋白條帶的相應分子量。將膠片置于圖像分析儀中，對目標條帶進行掃描及灰度分析。

6 統計學處理

數據用均數±標準差(mean±SD)表示，各組數據采用SPSS 13.0軟件系統處理，組間差異采用單因素方差分析(One-way ANOVA)。作圖軟件為Origin 5.0。

結 果

1 膿毒性休克后不同時點大鼠腸系膜上動脈GRP78和CHOP的表達變化及血管反應性變化

CLP后不同時點 SMA內質網應激標志分子GRP78和CHOP表達呈逐漸增高趨勢，并于CLP后6 h達到高峰，用牛磺酸處理后GRP78和CHOP表達顯著下降，見圖1。CLP膿毒性休克后血管反應性顯著下降，SMA對NE的量－效曲線明顯右移，Emax顯著下降(P＜0.01)，用牛磺酸處理后SMA對NE的量－效曲線明顯左移，反應性得到顯著恢復，Emax顯著上升(P＜0.05)，見圖2。上述結果提示膿毒性休克后血管存在內質網應激，內質網應激與休克后的血管低反應性密切相關。

Figure 1.The changes of protein expression of GRP78 and CHOP in SMA from CLP septic shock rats and the effect of taurine(Tau).C:control.圖1 CLP膿毒性休克大鼠腸系膜上動脈GRP78和CHOP表達變化及牛磺酸對其的影響

2 毒胡蘿卜素孵育后大鼠SMA對NE的反應性變化

經毒胡蘿卜素孵育24 h后，大鼠SMA的反應性顯著降低，對NE的量－效曲線明顯右移，Emax顯著下降(P＜0.01)，用牛磺酸處理后SMA對NE的量－效曲線明顯左移，Emax顯著上升(P＜0.05)，反應性得到顯著恢復，見圖3。這提示內質網應激能夠誘導血管反應性降低。

3 CsA孵育后大鼠SMA對NE的反應性變化

經毒胡蘿卜素孵育后，大鼠SMA的反應性顯著降低，對NE的量－效曲線明顯右移，Emax顯著下降(P＜0.01);用CsA共同孵育24 h后，大鼠SMA的反應性顯著升高，對NE的量－效曲線明顯左移，Emax顯著上升(P＜0.01)，見圖4。這提示毒胡蘿卜素誘導的內質網應激引起的血管反應性降低與MPTP開放有關。

Figure 4.The changes of the reactivity of SMA to NE after co-inbubation with cyclosporin A(CsA)and thapsin.Mean ± SD.n=8.＊＊P ＜0.01 vs control;##P ＜0.01 vs thapsin.圖4 CsA孵育后大鼠SMA對NE的反應性變化

討 論

膿毒性休克、創傷失血性休克等臨床重癥存在血管低反應性，即血管對血管活性藥物的反應降低或不反應。這種血管低反應性是導致嚴重創傷、休克晚期血壓降低，病人難以治療的重要原因之一。基于肌肉收縮效率取決于力/鈣比率(force/Ca2+ratio)，前期本實驗室提出并證實了“休克后血管平滑肌細胞肌肉收縮蛋白可能存在鈣失敏，鈣失敏在休克后血管低反應性的發生中起重要作用”的鈣失敏機制［5］，并發現PKG、PKC和Rho激酶參與休克后血管平滑肌細胞鈣敏感性的調控。針對鈣失敏機制，本實驗室發現小劑量的精氨酸加壓素［6］(arginine vasopressin，AVP;0.4 U/kg)具有一定的血管反應性恢復作用，但仍不能完全恢復至正常水平;此外，針對休克血管低反應性發生的受體失敏和膜超極化機制的治療措施也不能完全恢復血管反應性，這提示可能還有其它調控因素參與休克后血管低反應性的發生。基礎研究顯示內質網應激是由缺血缺氧、氧化應激、營養物質缺乏等病理生理刺激導致錯誤折疊或未折疊蛋白質在內質網腔內大量積聚的亞細胞應激。適度的內質網應激能使細胞發生未折疊蛋白反應(unfolded protein response，UPR)，從而調整和保護自己，包括暫停蛋白質的翻譯、上調內質網伴侶分子GRP78的表達等。當過強或持續的應激不緩解時則可誘導細胞凋亡，具體途徑包括上調內質網應激另一標志性分子CHOP的表達、誘導MPTP開放等。MPTP開放介導線粒體途徑的凋亡是內質網應激反應性凋亡的重要部分，并且參與多種疾病的發生。由此我們推測內質網應激可能通過MPTP誘導血管反應性降低。

本研究采用CLP膿毒性休克模型，觀察了CLP后不同時點GRP78和CHOP的表達變化，同時觀察了腸系膜上動脈血管反應性的變化。結果發現，CLP后隨著時間的延長，血管平滑肌細胞內質網應激標志分子GRP78和CHOP的表達增加，呈逐漸增高趨勢。而用內質網應激抑制劑牛磺酸處理后，GRP78和CHOP表達顯著下降。CLP膿毒性休克后血管反應性顯著下降，牛磺酸處理后血管反應性得到顯著恢復。結果提示內質網應激與休克后的血管低反應性密切相關。進一步采用離體血管環與內質網應激誘導劑毒胡蘿卜素孵育觀察其對血管反應性的影響及牛磺酸和CsA的作用。結果表明，毒胡蘿卜素能夠顯著降低離體血管環的血管反應性，牛磺酸能夠顯著恢復血管反應性，CsA也能夠顯著恢復血管反應性。上述結果提示，感染膿毒性休克可誘導內質網應激，后者通過誘導MPTP開放，導致血管的反應性降低。

目前普遍認為毒胡蘿卜素是體外誘導內質網應激的工具藥，其機制是通過抑制內質網的鈣轉運引起內質網鈣穩態失衡所致［6］。毒胡蘿卜素誘導血管低反應性是否是由于影響血管平滑肌細胞內鈣離子濃度所致，我們沒有直接測定胞內鈣離子濃度變化，但我們的實驗結果基本可以排除毒胡蘿卜素導致血管反應性下降是因胞內鈣離子濃度變化直接所致。因為毒胡蘿卜素處理后細胞漿內的鈣濃度應該是升高的，按理經毒胡蘿卜素處理后血管反應性應該增高，而本實驗結果卻顯示經毒胡蘿卜素處理后血管反應性是降低的，說明毒胡蘿卜素誘導血管反應性降低非細胞內鈣離子濃度直接引起。確切關系需以后同步觀察胞內鈣離子濃度變化與血管反應性的關系來確定。本實驗所用毒胡蘿卜素的劑量和作用時間，均參考相關文獻能誘導內質網應激的劑量和作用時間［7］。CsA 是公認的 MPTP 的抑制劑［8-9］。以往的研究顯示MPTP開放主要參與細胞的凋亡調控，有研究顯示MPTP介導的線粒體凋亡途徑參與了休克后血管高滲透性的發生［10］。本研究結果初步顯示MPTP參與了休克后血管低反應性發生。MPTP介導的線粒體凋亡途徑是否參與這一過程尚需深入研究。作為機體的內源性物質，牛磺酸具有滲透壓調控、鈣平衡調節、維持細胞膜穩定和抗氧化等作用，多個研究顯示牛磺酸能夠通過調節鈣穩態、抗氧化等作用抑制內質網應激，本實驗檢測的內質網應激標志分子結果也證實牛磺酸能夠抑制內質網應激。但牛磺酸發揮血管功能保護作用的確切機制尚需下步深入研究。

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