類風濕關節炎滑膜血管內皮細胞中Smoothened的表達及其意義*

朱尚玲， 彭蔚湘， 羅敏琪， 王明霞， 林灼鋒， 黃建林，

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis，RA)是以累及周圍關節為主要臨床表現的多系統慢性炎癥性自身免疫性疾病。其發病機制尚未完全明了，主要病理改變為慢性滑膜炎。新生的微血管形成在滑膜炎癥發展過程中具有非常重要的作用［1］。目前的研究認為微血管內皮細胞的凋亡受抑可能加速滑膜微血管的增生［2］。

在人類，Hedgehog(Hh)信號通路配體包括Shh(Sonic Hedgehog)、Ihh(Indian Hedgehog)和 Dhh(Desert Hedgehog)，其中Shh表達最為廣泛。Shh與12次跨膜蛋白Patched(Ptch)結合，激活7次跨膜蛋白Smoothened(Smo)，導致核轉錄因子Glioblastoma(Gli)蛋白水解被抑制，從而激活目標基因的轉錄［3］。其中，Smo的激活可導致下游基因的穩定和活化［4］。

近期的研究表明Shh可抑制血清饑餓誘導的內皮細胞的凋亡，但其是否依賴Smo起作用仍存在爭議。Polizio等［5］通過血清饑餓的方法誘導臍靜脈內皮細胞凋亡，認為Shh參與的內皮細胞抗凋亡機制是依賴 Ptch，而不依賴于 Smo的非經典途徑。Walshe等［6］發現Shh對無血清誘導的牛視網膜微血管周細胞和內皮細胞凋亡有保護作用，Smo特異性抑制劑cyclopamine可促進細胞凋亡。我們前期的研究表明［7］，RA患者外周血單個核細胞和滑膜組織(包含內皮細胞)中存在Shh信號通路的激活。作為Shh信號通路的關鍵分子，Smo是否參與了腫瘤壞死因子 α(tumor necrosis factor α，TNF-α)作用于內皮細胞后的抗凋亡調控機制，從而參與RA滑膜血管過度增生，尚未見相關報道。本文對此問題進行初步探討，現報道如下。

材料和方法

1 試劑與材料

人臍靜脈內皮細胞系EA.hy926購自中國科學院上海細胞庫。胎牛血清和DMEM培養液購自Hyclone。SmoⅠ抗購自Abcam，Ⅱ抗購自 Dako。重組人TNF-α購自 Prospec-Tany，放線菌素 D(actinomycin D，ActD)為Sigma進口分裝產品。細胞計數試劑盒(Cell Counting Kit-8，CCK-8)為日本同仁化學研究所產品。凋亡檢測試劑盒(Annexin V/Dead Cell Apoptosis Kit)購自Invitrogen。人Smo-siRNA、熒光標記siRNA及陰性對照siRNA雙鏈由上海吉瑪公司合成，X-tremeGENE siRNA轉染試劑購自Roche。

2 方法

2.1 免疫組織化學檢測關節滑膜組織Smo蛋白表達 收集4例我院關節外科病情中度活動(DAS28≥3.2)行關節置換術RA患者的滑膜組織，同時收集4例外傷或半月板損傷(無關節炎)者滑膜組織作為對照。滑膜組織用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋。包埋的組織切為4 μm厚度，經脫蠟，0.3%H2O2阻斷內源性過氧化酶活性10 min，微波爐抗原熱修復處理。10%山羊血清室溫封閉。滴加SmoⅠ抗，4℃過夜，PBS洗3次。滴加Ⅱ抗，室溫濕盒孵育40 min。PBS洗3次。DAB顯色后，蘇木素復染，脫水，透明，中性樹膠封片。胞膜出現棕黃色顆粒為陽性表達。

2.2 EA.hy926 細胞培養 EA.hy926 細胞接種于25 cm2培養瓶中，培養液為含10%胎牛血清的DMEM，置于37℃、含5%CO2的細胞培養箱中培養，細胞生長到80%融合時用于實驗。

2.3 Western blotting檢測 EA.hy926細胞 Smo蛋白表達 EA.hy926細胞以7×107/L密度接種于6孔板，每孔 2 mL。24 h后，予不同濃度 TNF-α(12.5 μg/L、25 μg/L、50 μg/L 和 100 μg/L)處理，同時設去離子水溶劑對照組。24 h后收集細胞并進行蛋白定量，各組取等量蛋白質加入上樣緩沖液，混勻后100℃水浴變性5 min。8%SDS-PAGE電泳，濕法轉膜。TBST緩沖液洗膜，5%脫脂奶粉封閉。加入兔抗人Smo多克隆抗體，4℃孵育過夜，TBST洗膜后，置于Ⅱ抗中室溫緩搖1 h。TBST洗膜，暗室操作曝光底片。采用Quantity One軟件進行掃描定量，取目的蛋白條帶吸光度值(A/mm2)與GAPDH蛋白吸光度值(A/mm2)的比值來表示蛋白的相對定量。

2.4 EA.hy926細胞轉染體外合成的特異性SmosiRNA EA.hy926細胞以7×107/L密度接種于6孔板。24 h后轉染熒光標記siRNA、Smo-siRNA或陰性對照siRNA，對照組只加轉染試劑。siRNA終濃度為20 nmol/L。6 h后熒光顯微鏡觀察siRNA轉染效率。或培養至48 h收集細胞并提取總蛋白。按上述方法進行Western blotting操作，檢測Smo蛋白的表達。

2.5 CCK-8法檢測細胞存活率 待EA.hy926細胞進入對數增長期，以3.5×107/L密度接種于96孔板。按以上方法進行轉染。轉染24 h后，按以下分組進行處理:(1)空白對照組;(2)TNF-α/ActD組;(3)處理組:TNF-α/ActD+轉染 Smo-siRNA;(4)陰性對照組:TNF-α/ActD+轉染陰性對照siRNA(NC-siRNA);(5)轉染試劑對照組:TNF-α/ActD+轉染試劑;(6)siRNA 對照組:TNF-α/ActD+siRNA。TNF-α終濃度為 12.5 μg/L，ActD 終濃度為 62.5 μg/L。培養24 h后，加入CCK-8液10 μL，避光孵育2 h，使用分光光度計在450 nm波長處檢測吸光度值(absorbance，A)，根據公式:細胞存活率(%)=(A實驗組－A空白組)/(A對照組－A空白組)×100%，計算細胞存活率。

2.6 流式細胞術檢測細胞凋亡 EA.hy926細胞以5×107/L密度接種于6孔板。按以上方法進行轉染和處理。轉染24 h后，加入TNF-α(終濃度為12.5 μg/L)和 ActD(終濃度為62.5 μg/L)。分組同 2.5。48 h后收集細胞，預冷PBS洗滌2次，細胞重懸至100 mL 1×結合緩沖液中，分別加入AlexaFluorR 488 Annexin V 5 μL 和 PI工作液(100 mg/L)1 μL，室溫避光染色15 min后，加入400 μL 1×結合緩沖液，輕柔混勻后置于冰上。使用FACScan Flow Cytometer檢測細胞的凋亡情況。

3 統計學處理

數據統計分析使用SPSS 17.0統計軟件。細胞存活率和凋亡率采用均數±標準差(mean±SD)表示。數據服從正態分布，根據方差齊性檢驗，多個樣本均數比較采用One-way ANOVA分析，兩兩比較采用LSD法，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 免疫組化檢測滑膜組織Smo蛋白表達

滑膜組織Smo蛋白表達結果見圖1，與對照組相比，RA組滑膜組織Smo表達強度明顯增加，且在血管內皮細胞中表達差異尤為顯著。

Figure 1.Expression of Smo protein in synovial tissue from RA patients detected by immunohistochemical staining.A，B:×40;C，D:×200;E，F:×400.A，C，E:RA group;B，D，F:control group.圖1 免疫組織化學檢測RA患者滑膜組織Smo的表達

2 Western blotting檢測TNF-α作用后Smo蛋白表達

TNF-α作用于EA.hy926細胞24 h后Smo蛋白表達條帶和灰度值分析結果見圖2。不同濃度TNF-α作用后，Smo蛋白表達增加，差異有統計學意義(P ＜0.05)。

Figure 2.Effects of different concentrations of TNF-α on expression of Smo protein in EA.hy926 cells.T0:TNF-α 0 μg/L;T12.5:TNF-α 12.5 μg/L;T25:TNF-α 25 μg/L;T50:TNF-α 50 μg/L;T100:TNF-α 100 μg/L.Mean±SD.n=3.*P ＜0.05 vs T0 group.圖2 不同濃度TNF-α對Smo蛋白表達的影響

3 siRNA轉染EA.hy926細胞的轉染效率及基因沉默效果

轉染效率的檢測結果見圖3。轉染熒光標記的siRNA 6 h，轉染效率達95%以上。正常情況下EA.hy926細胞呈梭形或多角形貼壁生長，見圖3A。轉染siRNA后細胞形態發生變化，部分細胞變圓并脫落，見圖3B、C。轉染外源性siRNA對細胞的形態和活力有一定影響。蛋白表達見圖4，與對照組相比，轉染Smo-siRNA 48 h后蛋白表達明顯降低，NC-siRNA對Smo蛋白表達無明顯影響。

Figure 3.Transfection efficiency of siRNA in EA.hy926 cells detected by fluorescence microscopy(×100).A:control;B:transfected with FITC-conjugated control siRNA for 6 h，under fluorescence microscope;C:transfected with FITC-conjugated control siRNA for 6 h，under normal microscope.圖3 熒光顯微鏡觀察EA.hy926細胞轉染效率

4 CCK-8法檢測細胞存活率

TNF-α/ActD組細胞存活率低于空白組(P＜0.05)。TNF-α/ActD+轉染Smo-siRNA組細胞存活率低于TNF-α/ActD+轉染NC-siRNA組，差異有統計學意義(P＜0.05)。TNF-α/ActD+轉染試劑和TNF-α/ActD+siRNA組細胞存活率與 TNF-α/ActD組相比，差異無統計學意義(P＞0.05)，見表1。

Figure 4.Expression of Smo protein in EA.hy926 cells after siRNA transfection.Smo-siRNA:transfected with Smo-siRNA for 48 h;NC-siRNA:transfected with negative control siRNA for 48 h.圖4 EA.hy926細胞轉染siRNA后Smo蛋白的表達

5 流式細胞術檢測細胞凋亡率

TNF-α/ActD組細胞凋亡率高于空白組(P＜0.05)。TNF-α/ActD+轉染Smo-siRNA組細胞凋亡率高于TNF-α/ActD+轉染NC-siRNA組凋亡率(P＜0.05)。TNF-α/ActD+轉染試劑和 TNF-α/ActD+siRNA組細胞凋亡率與TNF-α/ActD組相比，差異無統計學意義(P＞0.05)，見圖5和表2。

表1 EA.hy926轉染siRNA后的細胞存活率Table 1.Survival rates of EA.hy926 cells after siRNA transfection(%.Mean±SD.n=3)

Figure 5.Apoptotic rates of EA.hy926 cells examined by flow cytometry.A:blank;B:TNF-α/ActD;C:TNF-α/ActD+Smo-siRNA;D:TNF-α /ActD+transfection reagent;E:TNF-α /ActD+Smo-siRNA transfection;F:TNF-α /ActD+negative control(NC)siRNA transfection.圖5 流式細胞術檢測細胞凋亡率

討 論

在正常情況下，Shh信號通路在成人中的表達大為減少［8］。Hh信號通路的異常激活不僅為多種腫瘤的生長所必需，也與腫瘤的復發和侵襲有關［9］。Hh信號通路的激活存在配體依存性和非配體依存性［10］，配體依存性激活是指配體如Shh與受體Ptch1結合，從而引起Shh信號通路的異常激活;非配體依存性激活時指Hh信號通路的成員，如Ptch或Smo突變而觸發Hh信號通路異常的激活。研究表明Smo的過度表達可激活Shh信號通路，從而促進腫瘤的生長［11］。此外，Smo基因突變可導致基底細胞癌的發生［12］。而 Smo的特異性抑制劑 vismodegib(GDC-0449)在治療晚期基底細胞癌患者的1期臨床試驗中達到58%的應答率［13］。近期在基底細胞母斑綜合征患者中進行的隨機雙盲多中心安慰劑對照的臨床試驗結果表明，vismodegib可減輕腫瘤負荷，并減少新發腫瘤，阻止腫瘤的進展［14］。因此，Smo在腫瘤的發病中發揮重要的作用，并且是腫瘤的一個新的治療靶點。但Shh信號通路是否在類風濕關節炎發病中起作用仍不清楚。

表2 EA.hy926轉染siRNA后的細胞凋亡率Table 2.Apoptotic rates of EA.hy926 cells after siRNA transfection(%.Mean±SD.n=3)

本研究通過免疫組化的方法檢測RA患者滑膜組織血管內皮細胞中Smo的表達情況，結果顯示與對照組相比，RA組存在Smo的高表達，提示Smo可能參與RA的發病。因滑膜組織中主要為新生的微血管，相互交織成網狀，較難獲得內皮細胞并進行體外培養，故本研究采用人臍靜脈內皮細胞系EA.hy926作為此血管內皮細胞模型，初步探討Smo的表達情況及其意義。

多種炎癥細胞和炎癥因子參與RA慢性滑膜炎的產生。TNF-α在促炎細胞因子中占據主導地位［15］。Kasperczyk 等［16］對腫瘤細胞的研究證實，TNF-α可通過激活核轉錄因子(NF-κB)刺激Shh啟動子的活性。NF-κB激活可增加Shh mRNA和蛋白表達，由此促進細胞增殖和抵抗TRAIL誘導的細胞凋亡，從而促進腫瘤的生長。Ramirez等［17］的研究也提示Hh信號通路與磷酸肌醇3激酶(PI3K)和NF-κB通路存在交叉，且認為這些通路可能促進Hh在彌漫性大B細胞淋巴瘤中的異常激活。因此，本實驗采用TNF-α單獨作用于 EA.hy926細胞，并觀察TNF-α對細胞Smo蛋白表達的影響。本實驗結果提示正常情況下，EA.hy926細胞存在Smo的表達。經不同濃度 TNF-α刺激后，Smo蛋白表達上調。但TNF-α是否通過激活NF-κB通路，進而激活Shh信號通路并上調Smo蛋白的表達，有待進一步研究。

以往的研究認為TNF-α對內皮細胞凋亡并無明顯影響［18］，可能與TNF-α可同時激活凋亡和抗凋亡途徑有關。一般認為，TNF-α誘導細胞凋亡通過激活已經存在于胞內的蛋白，不需要新基因的表達。抗凋亡途徑則需要新的抗凋亡基因表達和蛋白的合成。因此，采用TNF-α與抑制RNA合成的ActD共同作用可誘導內皮細胞凋亡［18］。故本實驗采用TNF-α聯合ActD誘導EA.hy926細胞凋亡，并進一步觀察特異性抑制Smo表達對細胞存活和凋亡的影響。本研究采用 ActD的濃度為62.5 μg/L，預實驗發現其單獨作用24 h并不明顯誘導內皮細胞凋亡。TNF-α和ActD共同作用于內皮細胞，細胞存活率低于溶劑對照組，細胞凋亡率高于溶劑對照組，說明TNF-α和ActD共同作用可誘導細胞凋亡。本實驗采用RNAi技術干擾細胞Smo表達，結果提示轉染人Smo-siRNA雙鏈后，細胞表達Smo明顯降低，沉默效果較好。并應用CCK-8法和流式細胞術分別觀察此處理因素對經 TNF-α/ActD誘導的EA.hy926細胞存活和凋亡的影響。CCK-8結果顯示，沉默Smo的表達可明顯降低細胞存活率。流式細胞術結果也表明，轉染人Smo-siRNA后細胞凋亡率明顯高于轉染陰性對照siRNA。而轉染試劑或siRNA單獨作用對細胞的存活和凋亡無明顯影響。因此，我們的結果提示沉默 EA.hy926細胞Smo表達可促進 TNF-α/ActD誘導的細胞凋亡。

目前認為內皮細胞存在2條凋亡途徑，外源性途徑通過與細胞表面特異性死亡受體結合而啟動，內源性途徑起始于線粒體［18］。TNF-α可通過與TNF-α受體1結合和激活caspase-8誘導外源性凋亡途徑的發生。而血清饑餓可激活線粒體的凋亡途徑［19］。朱萍等［20］認為血清中存在的細胞因子，通過細胞中表達水平不同的代謝型谷氨酸受體，調節受體介導的胞外信號調節激酶(ERK)、蛋白激酶B(PKB/Akt)等信號通路，從而調控細胞生長與凋亡。Polizio等［5］的研究提示對于血清饑餓誘導的內皮細胞凋亡，Shh參與的抗凋亡調控機制是依賴Ptch，而不依賴于Smo的途徑。而本實驗研究發現Smo可能參與TNF-α作用于內皮細胞后的抗凋亡調控機制，我們推測Shh信號參與的抗凋亡調控機制可能與不同的刺激有關，不同刺激可能通過不同途徑誘導凋亡。

總之，本研究發現RA患者滑膜組織血管內皮細胞高表達Smo，Smo可能對TNF-α誘導的內皮細胞外源性凋亡有保護作用，從而促使滑膜血管新生，但其具體機制仍有待進一步研究。同時，本實驗也表明，從Smo阻斷Shh信號通路，可能成為RA治療的新靶點。

［1］ Szekanecz Z，Koch AE.Angiogenesis and its targeting in rheumatoid arthritis［J］.Vasc Pharmacol，2009，51(1):1-7.

［2］ Hida A，Kawakami A，Miyashita T，et al.Nitric oxide acts on the mitochondria and protects human endothelial cells from apoptosis［J］.J Lab Clin Med，2004，144(3):148-155.

［3］ Chari NS，McDonnell TJ.The sonic hedgehog signaling network in development and neoplasia［J］.Adv Anat Pathol，2007，14(5):344-352.

［4］ Jiang J，Hui CC.Hedgehog signaling in development and cancer［J］.Dev Cell，2008，15(6):801-812.

［5］ Polizio AH，Chinchilla P，Chen X，et al.Sonic Hedgehog activates the GTPases Rac1 and RhoA in a Gli-independent manner through coupling of smoothened to Giproteins［J］.Sci Signal，2011，4(200):pt7.

［6］ Walshe TE，Connell P，Cryan L，et al.Microvascular retinal endothelial and pericyte cell apoptosis in vitro:role of hedgehog and Notch signaling［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2011，52(7):4472-4483.

［7］ 王明霞，黃建林，朱尚玲，等.類風濕關節炎患者外周血單個核細胞Sonic Hedgehog信號通路表達的初步研究［J］.中國病理生理雜志，2012，28(3):483-487.

［8］ Rominger CM，Bee WL，Copeland RA，et al.Evidence for allosteric interactions of antagonist binding to the smoothened receptor［J］.J Pharmacol Exp Ther，2009，329(3):995-1005.

［9］ Stecca B，Ruiz I Altaba A.Context-dependent regulation of the GLI code in cancer by HEDGEHOG and non-HEDGEHOG signals［J］.J Mol Cell Biol，2010，2(2):84-95.

［10］ Berman DM，Karhadkar SS，Maitra A，et al.Widespread requirement for Hedgehog ligand stimulation in growth of digestive tract tumours［J］.Nature，2003，425(6960):846-851.

［11］Walter K，Omura N，Hong SM，et al.Overexpression of Smoothened activates the Sonic Hedgehog signaling pathway in pancreatic cancer-associated fibroblasts［J］.Clin Cancer Res，2010，16(6):1781-1789.

［12］ Xie J，Murone M，Luoh SM，et al.Activating Smoothened mutations in sporadic basal-cell carcinoma［J］.Nature，1998，391(6662):90-92.

［13］ Sekulic A，Migden MR，Oro AE，et al.Efficacy and safety of vismodegib in advanced basal-cell carcinoma［J］.N Engl J Med，2012，366(23):2171-2179.

［14］Tang JY，Mackay-Wiggan JM，Aszterbaum M，et al.Inhibiting the hedgehog pathway in patients with the basalcell nevus syndrome［J］.N Engl J Med，2012，366(23):2180-2188.

［15］Taylor PC，Feldmann M.Anti-TNF biologic agents:still the therapy of choice for rheumatoid arthritis［J］.Nat Rev Rheumatol，2009，5(10):578-582.

［16］Kasperczyk H，Baumann B，Debatin KM，et al.Characterization of sonic hedgehog as a novel NF-κB target gene that promotes NF-κB-mediated apoptosis resistance and tumor growth in vivo［J］.FASEB J，2009，23(1):21-33.

［17］ Ramirez E，Singh RR，Kunkalla K，et al.Defining causative factors contributing in the activation of hedgehog signaling in diffuse large B-cell lymphoma［J］.Leuk Res，2012，36(10):1267-1273.

［18］ Duriez PJ，Wong F，Dorovini-Zis K，et al.A1 functions at the mitochondria to delay endothelial apoptosis in response to tumor necrosis factor［J］.J Biol Chem，2000，275(24):18099-18107.

［19］ Lu Q.Transforming growth factor-β1 protects against pulmonary artery endothelial cell apoptosis via ALK5［J］.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2008，295(1):L123-L133.

［20］朱 萍，馮 吉，楊薈敏，等.血清通過調節mGluR1介導的信號通路調控細胞的生長與凋亡［J］.中國生物化學與分子生物學報，2010，26(4):332-340.