siRNA沉默WT1對小鼠足細胞Wnt/β-catenin和nephrin表達的影響*

周 靜， 袁偉杰△， 謝院生， 陳香美

流行病學調查顯示，與1988～1994年間相比，2005～2010年間美國慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)的患病率由 12.3% 增加至 14.0%;與2009年相比，2010年末美國發生終末期腎臟病(endstage renal disease，ESRD)的患者年發生率增加了約4%［1］。蛋白尿是 CKD患者的常見臨床表現。其中，腎小球濾過屏障受損尤其是裂孔隔膜受損是蛋白尿發生的主要原因。Nephrin作為免疫球蛋白超家族的跨膜成分，是腎小球裂孔隔膜的重要組成部分。損傷性刺激如糖代謝紊亂等可抑制腎小球nephrin的表達并誘導蛋白尿的發生，而維持足細胞nephrin的正常表達則可阻斷糖尿病腎病的進展［2-3］。有證據表明，Wnt/β-catenin通路異常激活可誘導足細胞nephrin分子表達下調和蛋白尿的發生，阻斷該通路的表達則會減輕足細胞損傷［4］。新近研究發現，Wnt/β-catenin通路的表達變化主要由WT1的負調控作用所致［5］。因此，本研究旨在進一步探討WT1與Wnt/β-catenin通路在足細胞損傷中的作用及關系。

材料和方法

1 細胞

條件永生化小鼠足細胞是從H-2Kb-tsA58轉基因小鼠腎臟中分離后建立的細胞系，由美國Mount Sinai醫學院Mundel教授贈送。

2 主要試劑

RPMI-1640培養液(Gibco)，胎牛血清(fetal bovine serum，FBS;Gibco)，I型膠原蛋白(Sigma)，小鼠重組干擾素 γ(interferon-γ，IFN-γ;PeproTech)，JetPRIMETM轉染試劑 (Polyplus)，兔抗小鼠單克隆WT1抗體(Abcam)，siRNA靶序列和siRNA對照序列(上海吉瑪)，羊抗小鼠多克隆nephrin抗體(RD)，兔抗小鼠單克隆Wnt1抗體(嘉美生物)，小鼠抗人多克隆β-catenin抗體 (Santa Cruz)，兔抗小鼠單克隆 p-βcatenin抗體 (Cell Signaling)，辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG、山羊抗小鼠IgG和驢抗山羊IgG(上海碧云天生物技術有限公司)，Trizol試劑(Invitrogen)。

3 主要方法

3.1 足細胞培養 足細胞培養方法參照文獻［6］。用含10%FBS的RPMI-1640培養基(添加小鼠重組IFN-γ)33℃條件下傳代培養足細胞，以含10%FBS的RPMI-1640培養基(不含IFN-γ)在37℃條件下誘導足細胞分化。

3.2 足細胞轉染及分組 轉染WT1 siRNA:將足細胞接種于25 cm2的培養瓶中，當細胞融合度達到50%～60%時進行轉染。足細胞分成以下3組:未轉染組:未經任何處理的足細胞;陰性對照組:轉染negative control組;轉染組:轉染WT1 siRNA組。利用JetPRIMETM進行轉染。轉染方法參照JetPRIMETM轉染試劑的說明書。轉染24 h及48 h后，分別采用real-time qRT-PCR和Western blotting法檢測WT1 mRNA和蛋白的表達情況，從而明確WT1 siRNA的轉染效率。陰性對照序列:正義鏈 5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'，反 義 鏈 5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3';WT1 siRNA的序列:正義鏈 5'-CUACAGCAGUGACAAUUUATT-3'，反義鏈 5'-UAAAUUGUCACUGCUGUAGTT-3'，均由上海吉瑪公司負責合成。

3.3 Real-time qRT-PCR 用Trizol試劑(Invitrogen)抽提細胞總RNA，用逆轉錄試劑盒(Promega)進行逆轉錄反應合成cDNA，以此cDNA為模板，進行擴增。采用熒光染料法，按照說明書進行操作，以GAPDH為內參照。引物設計參照GenBank中的mRNA序列，由北京賽百盛基因技術有限公司合成見表1。采用ΔΔCt法進行相對定量。

表1 引物序列Table 1.Sequences of the primers

3.4 Western blotting RIPA裂解液裂解細胞，4℃12 000×g離心30 min，提取細胞總蛋白。BCA試劑盒測定蛋白濃度，每組取60 μg蛋白上樣于10%SDS-PAGE電泳分離，電轉至PVDF膜，1×casein封閉約 1 h，分別加入 I抗(WT1、Wnt1、β-catenin、p-βcatenin及nephrin)，4℃過夜。辣根過氧化物酶標記的II抗37℃孵育1 h。利用UVP化學熒光成像系統(ChemiDoc-ItTM600 Imaging System)進行化學發光顯影，以β-actin作為內參校正。

3.5 MTT檢測細胞活力 收集對數生長期細胞，按4 400 cells/well接種于96孔板，各組干預方法同上述實驗。培養板充分吸盡上清后，每孔加入10 μL MTT溶液，繼續培養4 h后終止培養。每孔加入100 μL二甲基亞砜，置搖床上低溫振蕩10 min，酶標儀測量各孔A490。

4 統計學處理

計量資料采用均數±標準差(mean±SD)表示，組間比較采用單因素方差分析。采用 SPSS 13.0統計軟件進行統計學處理，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 WT1 siRNA轉染足細胞的效率

轉染12 h后，與未轉染組和對照組細胞相比，siRNA沉默WT1基因組細胞內mRNA水平顯著下降(P＜0.05)，轉染陰性對照組和未轉染組的胞內WT1 mRNA的水平無顯著差異。與未轉染組細胞相比，WT1 mRNA 下降了約 69.6%(P ＜0.05)，見圖 1;轉染24 h后，siRNA沉默WT1基因組細胞內WT1蛋白表達水平與未轉染組和陰性對照組相比顯著下降(P＜0.05)，轉染陰性對照組和未轉染組的胞內WT1蛋白表達水平無明顯差異。與未轉染組細胞相比，轉染組細胞WT1蛋白的表達水平下降了約61%(P＜0.05)，見圖 1、2。

Figure 1.Effect of RNA interference on WT1 mRNA expression detected by real-time qRT-PCR.Mean±SD.n=3.*P ＜0.05 vs non-transfection.圖1 轉染siRNA對WT1 mRNA表達的影響

Figure 2.Effect of RNA interference on WT1 protein expression detected by Western blotting.1:non-transfection;2:negative control;3:siRNA transfection.Mean±SD.n=3.*P ＜0.05 vs 1.圖2 轉染siRNA對WT1蛋白表達的影響

2 siRNA沉默對胞內Wnt1水平的影響

未轉染組、陰性對照組和siRNA轉染組的小鼠足細胞轉染36 h后，Wnt1 mRNA表達水平較未轉染組細胞有顯著增加(P＜0.05);轉染48 h后，Wnt1蛋白表達水平較未轉染組細胞有顯著增多(P＜0.05)，見圖3、4。

Figure 3.Effect of RNA interference on Wnt1 mRNA expression detected by real-time qRT-PCR.Mean±SD.n=3.*P ＜0.05 vs non-transfection.圖3 WT1沉默對足細胞Wnt1 mRNA水平的影響

Figure 4.Effect of RNA interference on Wnt1 protein expression detected by Western blotting.1:non-transfection;2:negative control;3:siRNA transfection.Mean±SD.n=3.*P ＜0.05 vs 1.圖4 WT1沉默對Wnt1蛋白水平的影響

3 siRNA沉默WT1基因對胞內β-catenin水平的影響

未轉染組、陰性對照組和siRNA轉染組的小鼠足細胞轉染36 h后，β-catenin mRNA表達水平無明顯改變;轉染48 h后，p-β-catenin蛋白的表達水平較未轉染組細胞有顯著下降(P＜0.05)，見圖5～7。

4 siRNA沉默對足細胞活力的影響

siRNA沉默WT1基因的小鼠足細胞在轉染24 h后，siRNA轉染組與未轉染組相比，細胞活力無明顯變化;在轉染48 h后，與未轉染組細胞相比，轉染組細胞活力明顯下降(P＜0.05)，見表2。

5 WT1沉默對小鼠足細胞nephrin mRNA的影響

siRNA沉默WT1基因的小鼠足細胞在轉染36 h后，nephrin mRNA表達水平較未轉染組細胞有顯著下降(P ＜0.05)，見圖8。

6 WT1沉默對nephrin蛋白水平的影響

siRNA沉默WT1基因的小鼠足細胞在轉染48 h后，nephrin蛋白表達水平較未轉染組細胞有顯著下降(P ＜0.05)，見圖9。

Figure 5.Effect of RNA interference on β-catenin mRNA expression detected by real-time qRT-PCR.Mean±SD.n=3.圖5 WT1沉默對足細胞β-catenin mRNA水平的影響

Figure 6.Effect of RNA interference on β-catenin protein expression detected by Western blotting.1:non-transfection;2:negative control;3:siRNA transfection.Mean±SD.n=3.圖6 WT1沉默對足細胞β-catenin蛋白水平的影響

Figure 7.Effect of RNA interference on p-β-catenin protein expression detected by Western blotting.1:non-transfection;2:negative control;3:siRNA transfection.Mean±SD.n=3.*P ＜0.05 vs 1.圖7 WT1沉默對足細胞p-β-catenin蛋白水平的影響

表2 MTT法檢測WT1沉默后足細胞的活力Table 2.Effects of WT1 siRNA on podocyte vitality detected by MTT assay(mean±SD.n=3)

Figure 8.Effect of RNA interference on nephrin mRNA expression in mouse podocytes detected by real-time qRTPCR.Mean±SD.n=3.*P ＜0.05 vs non-transfection.圖8 WT1沉默對足細胞nephrin mRNA水平的影響

Figure 9.Effect of RNA interference on nephrin protein expression detected by Western blotting.1:non-transfection;2:negative control;3:siRNA transfection.Mean±SD.n=3.*P ＜0.05 vs 1.圖9 WT1沉默對足細胞nephrin蛋白水平的影響

討 論

足細胞受損是慢性腎臟病發生發展的主要原因，其損傷程度可作為判斷慢性腎臟病預后的重要指標。由于對其損傷機制研究的有限性，我們目前對于足細胞的靶向治療仍處于探索階段。現今臨床常用治療方案并不能阻止腎臟疾病的進展。因此，闡明足細胞損傷修復的分子機制具有重要的臨床意義和實用價值。

WT1基因是一種具有雙重作用的轉錄調控因子，除參與腫瘤的發生外，其在足細胞發生發育及足細胞功能的維持上發揮重要作用［7］。研究發現，WT1可通過負調控Wnt/β-catenin通路的表達發揮其病理生理作用［5］。Wnt/β-catenin通路作為一條比較保守的信號通路可參與腫瘤的發生［8］。近年來，其慢性腎臟病發生發展中的作用逐漸被人們所認識。有證據表明，在糖尿病腎病或局灶階段性腎小球硬化的患者足細胞中可見Wnt1和β-catenin的高表達，異常升高的Wnt1或β-catenin可抑制nephrin的表達誘導足細胞損傷［9-10］。本研究結果顯示，在沉默WT1的表達后，足細胞內Wnt1分子表達明顯上調，提示Wnt/β-catenin通路可能處于激活狀態。

既往人們對腎母細胞瘤的研究中發現，WT1基因突變常伴有β-catenin在胞核內的大量蓄積［11］。β-catenin作為Wnt/β-catenin通路的關鍵調控因子，其表達水平主要受胞漿內破壞復合體(destruction complex)的調控。當Wnt/β-catenin通路處于激活狀態時，破壞復合體解離，β-catenin可在胞漿內大量蓄積，啟動下游基因的表達［12］。研究發現，β-catenin在正常足細胞結構與功能維持中發揮的作用較小，但其在介導阿霉素誘導小鼠足細胞損傷過程中至關重要［13］。在本實驗中，與未轉染組細胞相比，siRNA干擾組細胞內 β-catenin水平無明顯變化，而 p-βcatenin水平降低，提示β-catenin的降解減少并在胞漿內積聚并進入細胞核調控下游基因的表達，這一發現進一步說明了足細胞內Wnt/β-catenin信號通路在siRNA沉默WT1基因表達后處于激活狀態。為明確足細胞損傷程度，我們進一步檢測了足細胞活力與裂孔隔膜相關分子nephrin的表達水平變化，結果表明，與未轉染組細胞相比，轉染組細胞活力明顯下降;同時，其足細胞內nephrin mRNA和蛋白的表達水平均明顯下調。如前文所述，Wnt/β-catenin通路激活后可誘導腫瘤細胞增殖，但本研究并未發現足細胞增殖能力增強，可能與分化成熟的足細胞分裂增生能力有限或足細胞內nephrin分子表達下調后其結構或功能受損所致。因此，我們可以推測，轉錄因子WT1可通過負調控Wnt/β-catenin通路的表達誘導足細胞損傷。

綜上所述，通過siRNA沉默WT1基因的表達后會使其對Wnt/β-catenin通路的抑制作用減弱，誘導處于靜息狀態的Wnt/β-catenin通路異常激活從而導致足細胞損傷及裂孔隔膜分子nephrin的表達下降。這一發現為慢性腎臟病的早期診斷和治療開辟了新思路，同時也為新藥研發或有效信號轉導分子的干預研究提供了理論依據。

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