激活FXR抑制MRL/lpr狼瘡小鼠肝損害的研究*

連 帆， 王 于， 李家平， 楊建勇， 范文哲， 張應強， 許韓師， 梁柳琴， 楊岫巖

系統性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)是多系統損害的系統性自身免疫病，肝臟是常見的受累器官之一。據報道，SLE肝臟損害的發生率約為6% ～30%［1-2］。SLE引起的肝損害主要表現為肝腫大、黃疸、肝功能異常等，可以出現脂肪肝、門脈炎癥細胞浸潤、慢性活動性肝炎、肝硬化、膽汁淤積、肝細胞壞死等病理征象［3］。法尼酯衍生物X受體(farnesoid X receptor，FXR)是一種主要在肝腸系統等組織器官表達的膽汁酸受體，屬于激素核受體超家族的一員，在膽汁酸代謝及膽固醇代謝中發揮重要作用［4］。近年來有研究指出，FXR具有抗炎和調節免疫的作用，FXR在自身免疫性疾病中有其獨特的作用［5-6］。前期研究表明，FXR受體激動劑在動物模型中可減輕肝臟炎癥損傷［7］。本研究旨在觀察FXR在SLE肝損害中的作用，探討FXR激活改善SLE肝損害的部分可能機制。

材料和方法

1 實驗設計和動物模型建立

雌性MRL/lpr小鼠和BALB/c小鼠(18周齡)購自上海斯萊克公司。飼養環境溫度25℃恒溫，自由攝水，12 h交替照明。以伴刀豆球蛋白 A(concanavalin A，ConA;購自Sigma)誘導肝損害。尾靜脈一次性注射 ConA 20 mg/kg。對照組注射0.5 mL 0.9%生理鹽水。

MRL/lpr小鼠FXR的激活:在ConA注射前14 d開始，以含有1% 鵝去氧膽酸(chenodeoxycholic acid，CDCA;FXR 激動劑)［8］的飼料連續喂飼實驗動物。對照組MRL/lpr小鼠和 BALB/c小鼠在注射ConA前喂飼普通飼料。另空白對照組小鼠不喂飼CDCA，并在尾靜脈中注射生理鹽水。

2 觀察指標

2.1 測定指標 在注射 ConA 后0、4、8、12、16和24 h取血，離心收集血漿，檢測肝功能損傷指標丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase，ALT)和天冬氨酸氨基轉移酶(aspartate aminotransferase，AST);檢測炎癥細胞因子干擾素 γ(interferon γ，IFN-γ)、腫瘤壞死因子 α(tumor necrosis factor α，TNF-α)和白細胞介素6(interleukin-6，IL-6)。轉氨酶活性在全自動生化儀(Hitachi)上檢測。細胞因子檢測按照Bio-Plex Suspension Array系統標準流程操作。

2.2 qRT-PCR檢測 FXR mRNA表達 采用 qRTPCR技術，以 β-actin作為內參照，利用 Trizol-氯仿-異丙醇法提取總RNA，逆轉錄合成cDNA，加入上游引物、下游引物和SYBR預混液等共20 μL(Applied Biosystems)，反應體系在ABI PRISM 7700 PCR儀進行擴增。FXR上游引物5’-CCCTGCTTGATGTGCTACAA-3’，下游引物 5’-GTGTCCATCACTGCACATCC-3’;β-actin 上游引物 5’-CAGCTGAGAGGGAAATCGTG-3’，下游引物 5’-CGTGCCAATAGTGATGACC-3’。所得結果以 FXR/β-actin的積分吸光度比值表示。

2.3 Western blotting檢測FXR蛋白表達 取-80℃保存的肝臟組織，在冰面上提取蛋白，BCA法測定蛋白濃度，制備上樣蛋白，SDS-PAGE凝膠電泳，轉膜后5%脫脂奶粉封閉1 h，0.3%TBST洗膜3次，加入I抗 FXR 抗體(Santa Cruz)，4 ℃孵育過夜，0.1%TBST洗膜3次，加入辣根過氧化物酶標記的II抗(Santa Cruz)，室溫孵育1 h，洗膜，ECL化學發光法曝光。以β-actin作為內參照。

2.4 肝臟組織病理學檢查 取小鼠肝臟后，4%多聚甲醛固定24 h，逐級脫水，常規石蠟包埋，切片，HE染色。

3 統計學處理

數據以均數±標準差(mean±SD)表示，統計學分析采用SPSS 13.0統計軟件，兩組均數比較采用Student's t檢驗;多組間均數比較用One-way ANOVA，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 FXR在MRL/lpr狼瘡小鼠肝臟中低表達

取MRL/lpr狼瘡小鼠與BALB/c小鼠肝臟組織，應用qRT-PCR和Western blotting測定FXR的表達。結果顯示FXR mRNA及蛋白表達較BALB/c小鼠明顯降低，見圖1。

2 激活FXR減輕ConA誘導的自身免疫性肝炎炎癥損傷

ConA誘導的肝臟損傷在病理上表現為肝細胞壞死、單個核細胞浸潤、肝竇出血等。在激活FXR的MRL/lpr小鼠，ConA誘導的肝臟炎癥表現明顯減輕，見圖2。

Figure 2.FXR activation attenuated ConA-induced hepatitis(HE staining，×100).A:normal liver;B:ConA-induced hepatitis in BALB/c mice;C:ConA-induced hepatitis in MRL/lpr mice;D:ConA-induced hepatitis in MRL/lpr mice after FXR activation by CDCA.圖2 激活FXR減輕ConA誘導的肝損害

ConA誘導的小鼠肝損害還表現為轉氨酶活性的升高，峰值出現在注射ConA后12 h左右，隨后逐漸下降。在未受刺激時，BALB/c小鼠和MRL/lpr小鼠的轉氨酶水平相近，但在用ConA誘導肝損害后，MRL/lpr小鼠的轉氨酶活性明顯高于BALB/c小鼠。CDCA激活FXR的小鼠轉氨酶活性明顯低于MRL/lpr+ConA組，見圖3。

3 激活FXR減少炎癥因子的表達

BALB/c小鼠和MRL/lpr小鼠在注射ConA后，血清 TNF-α、IFN-γ和 IL-6的水平均明顯升高，以MRL/lpr小鼠的炎癥因子水平升高為著;而CDCA預處理的小鼠炎癥因子水平明顯降低，見圖4。

討 論

SLE是累及多器官、多系統的自身免疫性疾病［9-10］，肝臟是最常受累的器官之一，有報道，狼瘡肝損害在臨床上常被低估［3，11］。狼瘡肝損害的機制目前仍未明確，本研究探討FXR在狼瘡肝損害的作用，提示其激活可能減輕狼瘡肝損害，為狼瘡肝損害的治療提供了一個可能途徑。

Figure 3.FXR activation protected against liver injury in MRL/lpr mice.Mean±SD.n=10.*P ＜0.05 vs MRL/lpr+ConA.圖3 FXR激活對MRL/lpr小鼠肝臟的保護作用

Figure 4.FXR activation suppressed production of inflammatory cytokines in MRL/lpr mice.Mean ± SD.n=10.*P ＜0.05 vs MRL/lpr+ConA;△P＜0.05 vs BALB/c+ConA.圖4 FXR激活減少肝損害MRL/lpr小鼠炎癥因子釋放

FXR最初是作為膽汁酸運送的受體而被認識的，它已被證實參與了炎癥因子的表達［12-13］。FXR對肝臟自然殺傷T細胞的調節起作用［6］，在小腸和大腸炎癥中，FXR 激活減少 IL-1β、IL-2、IL-6、TNF-α和IFN-γ的分泌［14］。而本研究提供的證據表明FXR在狼瘡小鼠肝損害中起保護作用，FXR的激活能減輕肝損害。

MRL/lpr小鼠是高度模擬SLE的轉基因小鼠，在未受刺激時，MRL/lpr小鼠并未出現肝酶升高，這與前人的研究相吻合［14］。但我們的研究表明，FXR在MRL/lpr小鼠低表達，即使這些小鼠并未出現明顯肝損害的臨床征象。研究提示，FXR在狼瘡肝損害的病理生理機制中可能是一個負性調節因子，這一作用甚至存在于肝損害出現癥狀以前。

由于MRL/lpr小鼠和對照的正常BALB/c小鼠肝酶學在未受刺激時并無明顯差別。ConA誘導的肝臟炎癥是T細胞激活的結果，與SLE肝臟損害有許多相似之處，且伴有一系列炎癥因子的升高。在我們的研究中，MRL/lpr小鼠對ConA更為敏感，更易出現肝損害，這一點可部分解釋某些前人的研究，即MRL/lpr小鼠具有肝臟損害的趨向性，在較大周齡時容易出現自身免疫性膽管炎［15］。

CDCA激活FXR的MRL/lpr小鼠在ConA誘導的肝臟炎癥較 MRL/lpr+ConA組明顯減輕。TNF-α、IFN-γ和IL-6在狼瘡肝損害和ConA誘導的肝炎均有重要意義［16-18］。保護性因子IL-6和損傷性因子TNF-α、IFN-γ之間的平衡對肝損害的發生發展有重要作用。我們的研究顯示，在注射ConA后，MRL/lpr小鼠炎癥因子的水平較對照BALB/c更高，顯示其在未受刺激時可能存在某些未顯示出臨床癥狀的隱性病理狀態，因而對肝損害因子更敏感。激活FXR對MRL/lpr小鼠具有保護作用，其病理及炎癥因子表達均較FXR未激活組有明顯改善。這可能是因為FXR在CD4、CD8、CD19和CD14陽性的免疫細胞上表達，而CDCA激活FXR后減輕了T細胞介導的肝炎［19］。

［1］ 余月明.系統性紅斑狼瘡肝臟損害83例臨床觀察［J］.重慶醫學，2004，33(9):1394-1395.

［2］ 於 強，梅振武.系統性紅斑狼瘡的肝臟損害(附20例肝穿刺病理報告)［J］.風濕病學雜志，1997，2(2):14-16.

［3］ Runyon BA，LaBrecque DR，Anuras S.The spectrum of liver disease in systemic lupus erythematosus:report of 33 histologically-proved cases and review of the literature［J］.Am J Med，1980，69(2):187-194.

［4］ Zhu Y，Li F，Guo GL.Tissue-specific function of farnesoid X receptor in liver and intestine［J］.Pharmacol Res，2011，63(4):259-265.

［5］ Zhang Y，Yin L，Anderson J，et al.Identification of novel pathways that control farnesoid X receptor-mediated hypocholesterolemia［J］.J Biol Chem，2010，285(5):3035-3043.

［6］ Mencarelli A，Renga B，Migliorati M，et al.The bile acid sensor farnesoid X receptor is a modulator of liver immunity in a rodent model of acute hepatitis ［J］.J Immunol，2009，183(10):6657-6666.

［7］ Xing X，Burgermeister E，Geisler F，et al.Hematopoietically expressed homeobox is a target gene of farnesoid X receptor in chenodeoxycholic acid-induced liver hypertrophy［J］.Hepatology，2009，49(3):979-988.

［8］ Lian F，Xing X，Yuan G，et al.Farnesoid X receptor protects human and murine gastric epithelial cells against inflammation-induced damage［J］.Biochem J，2011，438(2):315-323.

［9］ 袁 敏，沈 南，唐元家，等.DNA甲基化與系統性紅斑狼癥［J］.中國病理生理雜志，2012，25(11):2217-2220，2224.

［10］梁柳琴，陳偉玲，邱 茜，等.ROCK對系統性紅斑狼瘡患者外周血T細胞黏附和遷移的調控［J］.中國病理生理雜志，2012，28(12):2270-2273.

［11］ Takahashi A，Abe K，Yokokawa J，et al.Clinical features of liver dysfunction in collagen diseases［J］.Hepatol Res，2010，40(11):1092-1097.

［12］ Kim I，Morimura K，Shah Y，et al.Spontaneous hepatocarcinogenesis in farnesoid X receptor-null mice［J］.Carcinogenesis，2007，28(5):940-946.

［13］ Yang F，Huang X，Yi T，et al.Spontaneous development of liver tumors in the absence of the bile acid receptor farnesoid X receptor［J］.Cancer Res，2007，67(3):863-867.

［14］ Vavassori P，Mencarelli A，Renga B，et al.The bile acid receptor FXR is a modulator of intestinal innate immunity［J］.J Immunol，2009，183(10):6251-6261.

［15］Ohba K，Omagari K，Murase K，et al.A possible mouse model for spontaneous cholangitis:serological and histological characteristics of MRL/lpr mice ［J］.Pathology，2002，34(3):250-256.

［16］Pasare C，Medzhitov R.Toll pathway-dependent blockade of CD4+CD25+T cell-mediated suppression by dendritic cells［J］.Science，2003，299(5609):1033-1036.

［17］ Wahl C，Wegenka UM，Leith?user F，et al.IL-22-dependent attenuation of T cell-dependent(ConA)hepatitis in herpes virus entry mediator deficiency［J］.J Immunol，2003，182(8):4521-4528.

［18］ Cao Q，Batey R，Pang G，et al.IL-6，IFN-γ and TNF-α production by liver-associated T cells and acute liver injury in rats administered concanavalin A ［J］.Immunol Cell Biol，1998，76(6):542-549.

［19］ Schote AB，Turner JD，Schiltz J，et al.Nuclear receptors in human immune cells:expression and correlations［J］.Mol Immunol，2007，44(6):1436-1445.