去氫駱駝蓬堿誘導HepG2細胞凋亡并增強其對5-氟尿嘧啶和順鉑的敏感性*

李 強， 曹明溶△， 劉志龍， 蔣建偉

(暨南大學 1附屬第一醫院普通外科， 2醫學院生物化學教研室，廣東 廣州 510632)

去氫駱駝蓬堿誘導HepG2細胞凋亡并增強其對5-氟尿嘧啶和順鉑的敏感性*

李 強1， 曹明溶1△， 劉志龍1， 蔣建偉2

(暨南大學1附屬第一醫院普通外科，2醫學院生物化學教研室，廣東 廣州 510632)

目的研究去氫駱駝蓬堿體外誘導HepG2細胞凋亡過程中c-Jun N末端激酶(JNK)途徑的作用，并觀察其聯合化療藥物對HepG2細胞的影響。方法CCK-8法檢測聯合或不聯合使用JNK特異性抑制劑SP600125對細胞增殖的抑制作用；克隆形成實驗觀察不同濃度藥物對細胞克隆形成的影響；Hoechst 33258染色法觀察細胞形態變化；PI單染檢測細胞亞二倍體率；Annexin V-PI雙染測定細胞早期凋亡水平；Western blotting檢測細胞聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)、JNK和p-JNK蛋白表達的改變；聯合5-氟尿嘧啶(5-FU)或順鉑(DDP)觀察細胞對化療藥物的敏感性。結果去氫駱駝蓬堿隨藥物濃度的升高而抑制作用增強，48 h后IC50為9.80 mg/L；去氫駱駝蓬堿能顯著抑制細胞克隆形成，并且導致細胞凋亡形態學變化；PI單染檢測發現細胞周期的G1期前有亞二倍體凋亡峰，Annexin V-PI 雙染檢測細胞出現明顯的早期凋亡細胞群；Western blotting檢測到隨著去氫駱駝蓬堿濃度增加PARP及p-JNK蛋白表達增加，JNK蛋白表達減少；聯合使用SP600125對細胞增殖的抑制作用減弱；聯合5-FU或順鉑明顯增強化療藥物對腫瘤細胞的抑制作用，增敏倍數分別為1.47和5.78倍。結論去氫駱駝蓬堿對HepG2細胞有增殖抑制作用，并誘導其凋亡，激活JNK信號通路可能是其主要機制之一；同時去氫駱駝蓬堿可以增強HepG2細胞對5-FU和順鉑的敏感性。

去氫駱駝蓬堿； HepG2細胞； c-Jun N末端激酶; 細胞凋亡

近年來研究發現，去氫駱駝蓬堿(harmine)可以通過人肝癌HepG2細胞發生G2/M期阻滯，并通過啟動線粒體途徑誘導HepG2細胞凋亡[1]，發揮抗肝癌作用。本文觀察去氫駱駝蓬堿誘導HepG2細胞凋亡的作用，探討c-Jun N末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)信號轉導途徑在細胞凋亡中的作用。

材 料 和 方 法

1主要材料和儀器

HepG2細胞由暨南大學生物化學教研室劉譽教授惠贈。去氫駱駝蓬堿純度為99.8%，棕色小瓶裝，購自西安飛達生物有限公司。DMSO、胰蛋白酶和Hoechst 33258均購自Sigma。新生牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司。RPMI-1640培養液購自Gibco。Annexin V-PI雙染試劑盒購自北京寶賽生物技術公司。CCK-8購自日本同仁化學研究所。SP600125(JNK抑制劑)及聚(ADP-核糖)聚合酶[poly(ADP-ribose)polymerase,PARP]、JNK和p-JNK抗體購自Cell Signal。

2方法

2.1細胞培養 HepG2細胞用含10%新生牛血清的RPMI-1640培養基，置37 ℃、5% CO2細胞培養箱常規培養，每3 d傳代1次，細胞貼壁達到80%時，以0.25%胰酶消化傳代。

2.2CCK-8法檢測細胞增殖抑制率 取對數生長期的細胞(5×107/L)，接種于96孔培養板，每孔100 μL，置37 ℃、5% CO2培養箱24 h后加藥，設細胞對照組、DMSO對照組(濃度為0.1%)和去氫駱駝蓬堿各組(終濃度為0.625、1.25、2.5、5、10、20 mg/L)，每組設5個復孔，置37 ℃、5% CO2培養箱培養48 h后，每孔加入10 μL CCK-8 試劑，繼續培養1 h，酶標儀檢測吸光度(A570)，按下列公式求增殖抑制率，增殖抑制率(% ) = (1-A實驗組/A對照組) ×100%，該實驗重復3次。

2.3克隆形成抑制實驗 在對數生長期，將細胞懸液調成300 cells/well接種于12孔培養板，置37 ℃、5% CO2培養箱24 h后加藥，設細胞對照組、DMSO對照組(濃度為0.1%)和去氫駱駝蓬堿各組(終濃度為0.625、1.25、2.5、5 mg/L)，每組設2個復孔，置37 ℃、5%CO2培養箱培養，7 d后，吸去培養液，PBS洗滌2次，甲醇∶冰醋酸(3∶1)固定液固定10 min后晾干，結晶紫染色15 min后流水沖洗，倒置顯微鏡下計數細胞克隆(>20個細胞記1個克隆)并拍照。

2.4Hoechst 33258染色觀察凋亡細胞形態學變化 在對數生長期，將細胞懸液調成1.0×104/L接種于6孔培養板，每組設2個復孔，置37 ℃、5% CO2培養箱24 h后加藥，設細胞對照組、DMSO對照組(濃度為0.1%)和去氫駱駝蓬堿組(5 mg/L)，繼續培養48 h后消化收集細胞，PBS重懸細胞，取250 μL細胞懸液涂片，室溫自然干燥，用甲醇∶冰醋酸(3∶1)固定液固定20 min，用Hoechst 33258 染色工作液(10 mg/L)避光染色10 min，流水沖脫，熒光顯微鏡觀察并拍照。

2.5PI單染和Annexin V-PI雙染實驗 在對數生長期，將細胞懸液調成1.0×107/L接種于12孔培養板，2 mL/well，每組設2個復孔，置37 ℃、5% CO2培養箱24 h后加藥，設細胞對照組、DMSO對照組(濃度為0.1%)和去氫駱駝蓬堿各組(終濃度為5、10和20 mg/L)，繼續培養48 h后按照試劑盒步驟消化收集細胞，上機檢測，BD FAC Sort Cell Quest 軟件分析處理結果。

2.6Western blotting檢測蛋白變化 收集6孔板(對照組和去氫駱駝蓬堿處理組細胞)，冷PBS洗2次，在孔板內加入細胞裂解液冰上裂解10 min，離心，吸取上清，BCA法測蛋白濃度。取適量蛋白，用12%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質，電泳后電轉至PVDF膜(恒壓100 V，轉膜1.5～2 h)，印跡膜在含有5%脫脂牛奶的TBS-T緩沖液中封閉2 h，GAPDH (1∶4 000)、PARP、JNK和p-JNK(1∶1 000)Ⅰ抗孵育過夜，洗滌，Ⅱ抗(1∶3 000)孵育1 h，ECL發光液孵育后，X光片感光定影，掃描紀錄。

2.7CCK-8法檢測聯合使用SP600125細胞增殖抑制率 取對數生長期的細胞，5×107/L接種于96孔培養板，每孔100 μL，置37 ℃、5% CO2培養箱24 h后加藥，設細胞對照組、DMSO組(濃度為0.1%)和SP600125組(濃度為10 μmol/L)、去氫駱駝蓬堿組(終濃度2.5 mg/L)和SP600125與去氫駱駝蓬堿聯合使用組，每組設5個復孔。SP600125預處理細胞1 h后，加入藥物，培養48 h，CCK-8法檢測各孔的吸光度，并計算增殖抑制率。

2.8藥物敏感實驗 取對數生長期的細胞，5.0×107/L，取100 μL接種于96孔培養板內，設5個復孔，置37 ℃、5% CO2培養箱24 h后加藥。對不同藥物的實驗都分為4組：細胞對照組、化療藥物組、去氫駱駝蓬堿組和化療藥物與去氫駱駝蓬堿聯合使用組。培養48 h，CCK-8法檢測各孔的吸光度，計算各組抑制率及IC50。去氫駱駝蓬堿終濃度為2.5 mg/L，順鉑和5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)終濃度均為1.25、2.5、5和10.0 mg/L。化療增敏倍數=單用時化療藥物IC50/聯合用藥時化療藥物IC50。并采用金正均Q值法判斷化療藥物與去氫駱駝蓬堿聯合使用的效果：Q=Ea+b/(Ea+Eb-Ea×Eb)，Ea和Eb分別為單用去氫駱駝蓬堿和單用化療藥物的抑制率，Ea+b為合并用藥的抑制率。式中分子代表“實測合并效應”，分母是“期望合并效應”，Q值是兩者之比，Q<0.85為拮抗作用，0.85≤Q<1.15為相加作用，Q≥1.15為協同作用。

3統計學處理

計量資料以均數±標準差(mean±SD)表示，SPSS 13.0統計軟件處理，采用完全隨機設計的單因素方差分析(One-way ANOVA)分析組間差異的顯著性，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1去氫駱駝蓬堿對HepG2細胞增殖抑制作用

不同濃度去氫駱駝蓬堿作用于細胞48 h后，與對照組相比出現增殖抑制作用，去氫駱駝蓬堿為1.25 mg/L時，差異有統計學意義(P<0.05)，IC50為9.80 mg/L，空白組與DMSO組相比無顯著差異(P>0.05)。隨著去氫駱駝蓬堿濃度的增加，細胞的增殖抑制越明顯，表明去氫駱駝蓬堿以劑量依賴的方式抑制HepG2細胞的增殖，見圖1。不同濃度去氫駱駝蓬堿作用細胞7 d后，與對照組相比較克隆形成數量明顯減少，且克隆逐漸變小，去氫駱駝蓬堿濃度為1.25 mg/L時，即產生明顯的克隆形成抑制作用，當濃度達到5 mg/L時，基本無克隆細胞株形成，見圖2。

2去氫駱駝蓬堿誘導HepG2細胞凋亡

Hoechst 33258染色可見，去氫駱駝蓬堿組細胞核固縮、邊聚、裂解、凋亡小體形成等凋亡形態學變化，見圖3。不同濃度去氫駱駝蓬堿作用細胞48 h后，用Annexin V-PI雙染流式細胞儀檢測細胞早期凋亡率，隨著去氫駱駝蓬堿濃度增加，早期凋亡率明顯增加，各組的早期凋亡率分別為：(7.12±0.21)%、(7.23±0.35)%、(20.07±0.46)%、(31.75±0.24)%和(63.91±0.67)%,見圖4A；同時實驗組細胞出現明顯的亞二倍體凋亡峰，隨著去氫駱駝蓬堿濃度的增大，HepG2細胞的亞二倍體百分率增加，各組的亞二倍體率分別為：(5.23±0.11)%、(4.57±0.45)%、(10.67±0.36)%、(18.75±0.76)%和(21.35±0.77)%，見圖4B。

Figure 1. Effect of harmine on the proliferation of HepG2 cells determined by CCK-8 assay. 1: control; 2: DMSO; 3～8: 0.625, 1.25, 2.5, 5, 10 and 20 mg/L harmine, respectively. Mean±SD.n=3.#P<0.05vs1 or 2.

圖1CCK-8法檢測去氫駱駝蓬堿對細胞存活率的影響

Figure 2. Colony formation assay was used to evaluate the effects of harmine on the proliferation of HepG2 cells. HepG2 cells were treated with 0.625, 1.25, 2.5 and 5 mg/L harmine for 7 d.

圖2克隆形成實驗觀察去氫駱駝蓬堿對細胞增殖的抑制作用

Figure 3. Harmine-induced apoptosis of HepG2 cells assessed by Hoechst 33258 staining (×200). Morphology of HepG2 cells exposed to harmine at different concentrations was observed under fluorescence microscope.A:DMSO;B:0 mg/L harmine;C:5 mg/L harmine.

圖3Hoechst33258染色觀察細胞形態學變化

Figure 4. Apoptosis of HEG2 cells detected by flow cytometry.A:Annexin V-FITC/PI staining,B:sub-G1fraction.Mean±SD.n=3.#P<0.05vsDMSO or 0 mg/L harmine.

圖4流式細胞術檢測細胞凋亡

3Westernblotting檢測PARP、JNK和p-JNK蛋白的表達

Western blotting檢測去氫駱駝蓬堿作用于HepG2細胞48 h后，PARP和p-JNK蛋白隨去氫駱駝蓬堿濃度增加而增加，JNK蛋白量減少，見圖5。

4CCK-8檢測聯合SP600125對細胞增殖抑制率的影響

與空白組比較，JNK單獨作用不對細胞產生增殖抑制作用，SP600125預處理細胞1 h后，加入去氫駱駝蓬堿48 h后，細胞存活率增加，見圖6。

5藥物敏感性實驗

5.15-FU單用或與去氫駱駝蓬堿聯用HepG2的增殖抑制作用 單獨5-FU作用細胞48 h，IC50為7.12 mg/L，與2.5 mg/L去氫駱駝蓬堿聯合作用后，IC50為4.86 mg/L，增敏倍數為1.47。其中1.25 mg/L 5-FU與2.5 mg/L去氫駱駝蓬堿聯合為協同作用，Q值為1.23，見表1。

Figure 5. The effect of harmine on the protein expression evaluated by Western blotting.

圖5Westernblotting檢測HepG2細胞PARP、JNK和p-JNK蛋白的表達

Figure 6. Effects of harmine (HAM) and SP600125 on HepG2 cell viability. 1:DMSO group; 2:control group; 3: 2.5 mg/L HAM group; 4:SP600125 group; 5：2.5 mg/L HAM+SP600125 group.Mean±SD.n=3.*P<0.05vsDMSO or control group.

圖6JNK特異性抑制劑對HepG2細胞增殖抑制的影響

表15-FU聯合2.5mg/L去氫駱駝蓬堿對HepG2細胞增殖的抑制作用

Table 1. Effects of HAM in combination with 5-FU on HepG2 cell growth inhibition(mean±SD.n=3)

5-FU5-FUcombinedwith2.5mg/LHAMQvalueConcentration(mg/L)Inhibitoryrate(%)5-FUconcentration(mg/L)Inhibitoryrate(%)00018.12±2.20—1.2510.20±2.151.2532.79±2.13#1.232.524.01±3.952.535.79±4.340.95527.89±4.27540.12±4.600.981039.97±2.781047.24±3.190.932095.67±5.12———

#P<0.05vs1.25 mg/L 5-FU alone.

5.2順鉑單用或與去氫駱駝蓬堿聯用HepG2的增殖抑制作用 單獨順鉑作用細胞48 h，IC50為14.67 mg/L，與2.5 mg/L去氫駱駝蓬堿聯合作用后，IC50為2.54 mg/L，增敏倍數為5.78。其中1.25 mg/L順鉑與2.5 mg/L去氫駱駝蓬堿聯合為協同作用，Q值為1.17，見表2。

表2順鉑聯合2.5mg/L去氫駱駝蓬堿對HepG2細胞增殖的抑制作用

Table 2. Effects of HAM in combination with cisplatin on HepG2 cell growth inhibition(mean±SD.n=3)

CisplatinCisplatincombinedwith2.5mg/LHAMQvalueConcentration(mg/L)Inhibitoryrate(%)Cisplatinconcentration(mg/L)Inhibitoryrate(%)00018.12±2.20—1.2530.97±4.151.2550.78±3.53#1.172.546.51±5.052.554.27±6.740.97560.96±7.27567.25±5.660.991067.40±6.581070.78±4.390.962090.86±7.12———

#P<0.05vs1.25 mg/L cisplatin alone.

討 論

駱駝蓬屬(Peganum)植物為蒺藜科多年生草本植物，具有堅固筋脈、助陽暖陰、消除黏稠體液等功能，主治筋脈軟弱、骨關節痛、神昏頭痛等癥[2-3]。駱駝蓬植物的主要化學成分為生物堿，主要包括駱駝蓬堿(harmaline)、去氫駱駝蓬堿和哈爾滿堿(harman)。去氫駱駝蓬堿是其中的主要有效成分之一，別名為哈爾明堿、肉葉云香堿，是淡黃色針狀晶體，分子量為236.7，分子式為C13H12N2O，它在駱駝蓬種子中的含量高、結構穩定且具有肯定的抗腫瘤作用。從80年代早期開始，國內就對駱駝蓬堿類化合物抗腫瘤活性及毒性展開了臨床研究，其中以去氫駱駝蓬堿的抗腫瘤作用最強，體外實驗發現，去氫駱駝蓬堿對宮頸癌HeLa細胞、胃癌MGC-803和HGC27細胞、肝癌BEL-7402細胞、鼻咽癌CNE2細胞、人胰腺癌AsPC1細胞、白血病K562細胞、小鼠結腸癌Colon26細胞等多種體外培養的腫瘤細胞有明顯的抑制作用[4-9]。在體內抗腫瘤活性方面，去氫駱駝蓬堿對S-180小鼠、網織細胞肉瘤L2和小鼠肝癌都有顯著療效，與順鉑、阿霉素聯用有明顯協同作用。在臨床上駱駝蓬粗提物用于治療未手術或不宜手術的惡性腫瘤，取得了較好的臨床效果[10-11]。

近來研究表明，腫瘤是細胞增殖過度和分化異常的疾病，也是凋亡異常的疾病，通過誘導腫瘤細胞使其重新恢復凋亡，更加符合人體生理性細胞死亡過程，可以明顯減輕或消除化療藥物所導致的毒副作用，是一種有效的抗癌途徑。目前化療藥物種類繁多，但都不可避免產生很多毒副作用，比如骨髓抑制、脫發、神經毒性等等[12-13]。許多抗癌藥物的作用機理都與它們誘導腫瘤細胞的凋亡有關[14-15]。在本實驗中CCK-8及克隆形成實驗結果表明去氫駱駝蓬堿可有效抑制HepG2細胞的增殖生長，其抑制細胞增殖的作用隨藥物濃度升高而增強，表現出劑量依賴性，當藥物濃度為1.25 mg/L時，細胞克隆數明顯減少并減小。Hoechst 33258染色觀察可見明顯核固縮、邊聚、裂解、凋亡小體形成等細胞凋亡形態學變化。進一步流式細胞術可見隨藥物濃度增加，早期凋亡細胞和亞二倍體細胞群明顯增加，亦呈濃度依賴性。結果表明，去氫駱駝蓬堿可抑制HepG2細胞增殖，誘導其凋亡。

PARP是DNA修復酶，作為caspase-3的作用底物，所以PARP又被稱為死亡底物，PARP蛋白的剪切是細胞凋亡的標志。隨著藥物濃度增加，PARP蛋白表達逐漸增加。在我們前期研究中發現去氫駱駝蓬堿活化caspase-3誘導HepG2細胞的凋亡，caspase-3作為細胞凋亡的執行因子，受多種信號轉導通路的調控。JNK也被稱為壓力激活的蛋白激酶(stress-activated protein kinase, SAPK)，作為絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)家族中的重要成員，是細胞內重要的信號轉導通路之一[16-17]。JNK通過其氨基酸殘基端的磷酸化而活化，一旦被激活，胞漿中的JNK轉位到細胞核，對轉錄因子c-Jun、活化轉錄因子2(activating transcription factor 2,ATF2)等磷酸化促進新蛋白質的合成或引起細胞凋亡。本研究中發現去氫駱駝蓬堿可以誘導JNK信號通路活化，使p-JNK蛋白表達隨藥物濃度增加明顯上調。應用特異性JNK阻斷劑SP600125，預處理HepG2細胞后則能夠顯著降低該藥對HepG2細胞的增殖活性。去氫駱駝蓬堿，說明去氫駱駝蓬堿可能通過線粒體通路誘導細胞凋亡，JNK位于caspase-3的上游，但SP600125并不能完全阻斷caspase-3和PARP活化，說明去氫駱駝蓬堿可能通過其它通路誘導細胞凋亡，要闡明所有參與去氫駱駝蓬堿誘導HepG2細胞凋亡反應的信號轉導通路，尚需進一步相關研究。

5-FU和順鉑都是目前常用的化療藥物，但毒副作用大，導致病人常常難以耐受。在體外實驗中我們發現，去氫駱駝蓬堿與5-FU和順鉑聯合作用，后者IC50較單獨使用時明顯降低，增敏倍數分別為1.47和5.78，與去氫駱駝蓬堿合用時，計算出Q值大于1.15，表明兩者合用有協同抗腫瘤作用。肝癌對化療藥物反應不敏感，且容易產生耐藥性，今后可以進一步研究協同效應機制，并用荷肝癌動物模型驗證，期望臨床上聯合中藥化療可以減輕毒副作用，提高化療效果。

[1] Cao MR, Li Q, Liu ZL, et al. Harmine induces apoptosis of HepG2 cells via mitochondrial signaling pathway[J]. Hepatobiliary Pancreat Dis Int, 2011, 10(6):599-604.

[2] 程雪梅,劉玉琴,謝惠定,等.駱駝蓬屬植物種子中去氫駱駝蓬堿和駱駝蓬堿的HPLC-熒光檢測法測定[J]. 中國藥學工業雜志,2008,39(6):443-446.

[3] 趙 婷,王長虹,王崢濤.駱駝蓬屬植物中生物堿類化學成分及其藥理活性研究進展[J].國際藥學研究雜志,2010,37(5):333-338.

[4] 王長虹,程雪梅,劉忠淵,等.駱駝蓬種子提取物及其β咔保啉生物堿對DNA拓撲異構酶II活性的抑制作用[J]. 中國臨床藥理學雜志,2008,24(5):422-425.

[5] 王錦軍,張秀梅,羅 磊.去氫駱駝蓬堿體外抗消化道腫瘤活性和對小鼠脾細胞增殖反應的抑制作用[J]. 中國現代應用藥學雜志,2008,25(7):607-608.

[6] 劉俊玲,烏慶超,范傳波,等.去氫駱駝蓬堿誘導白血病細胞凋亡的實驗研究[J].中國中醫藥科技,2011,18(3):202-203.

[7] 宋震亞,劉濟仁,陸新良,等.去氫駱駝蓬堿誘導人胃腺癌SGC-7901細胞凋亡[J].中藥材,2006,29(6):571-573.

[8] 郭 亮,孫 潔,范文璽,等.去氫駱駝蓬堿衍生物的合成和抗腫瘤活性研究[J].中國現代應用藥學,2012,29(5):385-388.

[9] Jahaniani F, Ebrahimi SA, Rahbar-Roshandel N, et al. Xanthomicrol is the main cytotoxic component of Dracocephalum kotschyii and a potential anti-cancer agent[J]. Phytochemistry, 2005, 66(13): 1581-1592.

[10] 陳維良,朱愛軍,杜昆澤,等.去氫駱駝蓬堿脂質體的制備和體外釋放特性[J].抗感染藥學,2012,9(4):268-272.

[11] 丁志榮,滕 亮,戴秀勇,等.鹽酸去氫駱駝蓬堿乳膏處方篩選及其止癢藥效學研究[J]. 中成藥,2010,32(5):753-757.

[12] Chau GY, Lui WY, Tsay SH, et al. Postresectional adjuvant intraportal chemotherapy in patients with hepatocellular carcinoma: a case-control study[J]. Ann Surg Oncol, 2006, 13(10): 1329-1337.

[13] 徐小平,陳興華,卜 瑞.駱駝蓬總堿對孕鼠胚胎期胎鼠生長發育的影響[J]. 陜西中醫學院學報,2009,32(2):53-57.

[14] Lah JJ, Cui W, Hu KQ. Effects and mechanisms of silibinin on human hepatoma cell lines[J]. World J Gastroenterol, 2007, 13(40): 5299-5305.

[15] Edderkaoui M, Odinokova I, Ohno I, et al. Ellagic acid induces apoptosis through inhibition of nuclear factor κB in pancreatic cancer cells[J]. World J Gastroenterol, 2008, 14(23): 3672-3680.

[16] 李素芳,林 森,張幼怡,等.p38 MAPK參與千金藤素誘導的心肌細胞凋亡[J].中國病理生理雜志,2011,27(4):638-642.

[17] 蔡清清,林天歆,范新蘭,等.13-MTD通過激活MAPK途徑和抑制Akt存活途徑誘導乳腺癌MCF-7細胞凋亡[J].中國病理生理雜志,2009,25(5):873-876.

HarmineinducesapoptosisofHepG2cellsviaJNKsignalingpathwayandenhancestheirchemosensitivityto5-fluorouracilandcisplatin

LI Qiang1, CAO Ming-rong1, LIU Zhi-long1, JIANG Jian-wei2

(1DepartmentofGeneralSurgery,theFirstAffiliatedHospital,2DepartmentofBiochemistry,SchoolofMedicine,JinanUniversity,Guangzhou510632,China.E-mail:tcaomr@jnu.edu.cn)

AIM: To investigate the proliferation-inhibitory and apoptosis-inducing effects of harmine on human hepatocarcinoma HepG2 cells.METHODSThe proliferation of HepG2 cells was determined in the absence or presence of a JNK inhibitor SP600125 by Cell Counting Kit-8 (CCK-8) assay and colony formation test. The morphology of HepG2 cells was observed by Hoechst 33258 staining under fluorescence microscope. The cell apoptosis was analyzed by Annexin V-PI staining. The expression of apoptosis-regulated proteins,poly(ADP-ribose) polymerase (PARP),c-Jun N-terminal kinase (JNK) and p-JNK, was detected by Western blotting. The sensitizing effects of harmine on HepG2 cells to chemotherapeutic drugs 5-fluorouracil (5-FU) and cisplatin were determined by CCK-8 assay.RESULTSHarmine inhibited the proliferation of HepG2 cells and induced apoptosis in a dose-dependent manner. After the JNK signaling pathway was blocked by SP600125, the cell apoptotic rate decreased significantly. Hoechst 33258 staining revealed that the nuclear fragmentation, chromosomal condensation, cell shrinkage and attachment loss appeared in the HepG2 cells treated with harmine. The percentage of the sub-G1fraction was increased and the population of early apoptotic cell death was observed. Apoptosis of HepG2 cells with harmine treatment was associated with the activation of JNK. Combined with harmine, the IC50values of 5-FU and cisplatin for the tumor cells were 1.47 and 5.78 times sensitized as compared with the correspon-ding single drug treatment groups, respectively.CONCLUSIONHarmine exhibits an anti-proliferative effect on HepG2 cells by inducing apoptosis. The JNK signaling pathway is involved in the apoptosis of HepG2 cells. Harmine enhances the chemosensitivity of the cells to 5-FU and cisplatin.

Harmine; HepG2 cells; c-Jun N-terminal kinase; Apoptosis

R735.7

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.02.017

1000-4718(2013)02-0284-06

2012-10-15

2012-11-19

廣東省科技計劃(No.2010B031600248)；廣東省中醫藥管理局基金資助項目(No.20122114)

△通訊作者 Tel: 020-38688108； E-mail: tcaomr@jnu.edu.cn