細胞外信號調節激酶-2在結腸癌中的表達及臨床意義

王 斌 夏 博 趙光忠 侯利濤 李增軍

1.山東省臨朐縣人民醫院普外科，山東臨朐 262600；2.山東省腫瘤醫院外四科，山東濟南 250117

結腸癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，僅2000年全球即有945 000例新發病例，僅次于肺癌、乳腺癌，居惡性腫瘤發病率的第3位[1]。結腸癌病因不明，預后較差，5年存活率不超過40%。目前結腸癌的病因尚不清楚，早期診斷成為改善患者預后的關鍵[2－3]。在結腸癌的生物學行為中，侵襲和轉移是影響結腸癌患者療效和預后的重要因素。尋找有關控制侵襲、防止浸潤的因素是目前結腸癌防治研究的重要課題之一。因此，本研究應用免疫組織化學方法，研究細胞外信號調節激酶（ERK）在結腸癌與癌旁組織中的表達情況，分析ERK蛋白與結腸癌病理因素的關系，探討ERK在結腸癌發生中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集山東省臨朐縣人民醫院2008年1月～2010年12月經手術病理證實的結腸癌79例患者的結腸癌組織及癌旁組織標本，所有患者的年齡、性別、腫瘤部位、組織學類型、腫瘤直徑、浸潤深度、淋巴結或遠處轉移情況、Dukes分期等病理資料完整、可查。在79例結腸癌患者中，男41例，女38例；＜60歲者40例，≥60歲者39例；結腸癌位于右半結腸35例，位于左半結腸49例；腫瘤直徑＜5 cm者36例，≥5 cm者43例；Dukes A期14例，B期31例，C期22例，D期12例；高中分化腺癌58例，低分化腺癌21例；無淋巴結轉移45例，有淋巴結轉移34例；浸潤深度：未穿透肌層者13例，浸潤至漿膜或漿膜外者66例；癌胚抗原（CEA）水平＜5 μg/L 者 22 例，≥5 μg/L 者 57 例。 另選擇同期行結腸切除的79例非腫瘤患者組織標本作為正常組織對照，其中，潰瘍性結腸炎39例，腸結核11例，外傷29例。本研究經醫院倫理委員會通過，患者知情同意，并簽署知情同意書。

1.2 ERK-2蛋白表達檢測方法

采用免疫組化鏈霉菌抗生物素蛋白－過氧化酶（streptavidin－peroxidase，SP）法檢測 ERK－2 蛋白表達情況。對石蠟切片常規脫蠟脫水處理，放置于3%過氧化氫（H2O2）溶液中，室溫孵育約 30 min，給予磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌5 min×2遍，滴加正常山羊血清封片40 min，而后滴加1∶30稀釋的ERK－2抗體，置于4℃條件下孵育過夜；第2天取出切片，PBS沖洗，依次滴加生物素標記羊抗鼠二抗及鏈霉卵白素，37℃條件孵育30 min；采用二氨基聯苯胺（DAB）顯色，復染采用蘇木精，乙醇脫水、二甲苯透明化，最后采用中性樹膠封片保存。采用HPLAS－1000彩色病理圖像免疫組化測量系統7.0版對圖像進行分析，判斷ERK－2表達情況。

1.3 結果判定

ERK－2蛋白免疫組化陽性表達于細胞質和（或）細胞核，呈黃色或棕黃色顆粒。每張切片在光鏡下隨機選取5個高倍視野，每個視野計數100個瘤細胞，根據陽性細胞總數計算陽性細胞百分率。按著色強度不同分別給予計分：無色為0分，淺黃色或黃色為1分，棕黃色為2分。陽性細胞數評分分別為：＜10%為0分，10%～50%為1分，＞50%為2 分。 兩項合計乘積 0 分為陰性（－），1～2 分為弱陽性（+），4分為強陽性（++）。

1.4 統計學方法

采用統計軟件SPSS 15.0對數據進行分析，正態分布的計量資料以均數±標準差（±s）表示，兩獨立樣本的計量資料采用t檢驗；計數資料以率表示，采用χ2檢驗；生存率分析采用Log－rank檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 正常結腸組織、癌旁組織和結腸癌組織中ERK-2蛋白陽性表達率比較

結腸癌組織中ERK－2蛋白陽性表達率[75.9%（60/79）]高于癌旁組織[51.9%（41/79）]及正常組織[13.9%（11/79）]，差異均有統計學意義（P ＜ 0.05或 P ＜ 0.01）。見表1、圖1、2。

表1 細胞外信號調節激酶-2蛋白在結腸癌組織、癌旁組織及正常組織中陽性表達分布[n（%）]

2.2 ERK-2蛋白表達與結腸癌臨床病理特征的關系

ERK－2蛋白陽性表達率在不同年齡（＜60歲、≥60歲）[77.5%（31/40）、74.4%（29/39）]、性別（男/女）[70.7%（29/41）、68.4%（26/38）]、Dukes分期（A、B、C、D 期）[73.3%（11/15）、76.7%（23/30）、71.4%（10/14）、70.0%（14/20）]、CEA 水 平（＜5 μg/L、≥5 μg/L）[68.2%（15/22）、64.9%（37/57）]患者間比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；ERK－2蛋白陽性表達率在不同分化程度（高中分化/低分化）[82.8%（48/58）、57.1%（12/21）]、 浸潤深度（未穿透肌層/漿膜或漿膜外）[46.2%（6/13）、72.7%（48/66）]和淋巴結轉移（陽性/陰性）[76.5%（26/34）、53.3%（24/45）]患者間比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。 見表2。

表2 細胞外信號調節激酶-2蛋白陽性表達與結腸癌臨床病理特征的關系[n（%）]

2.3 細胞外信號調節激酶-2蛋白陽性表達與預后的關系

ERK－2蛋白陽性表達患者12個月生存率為58.2%，ERK－2蛋白陰性表達患者12個月生存率為60.4%，兩者比較差異無統計學意義（P＞0.05）；ERK－2蛋白陽性表達患者24個月生存率為38.7%，低于ERK－2蛋白陰性表達患者24個月生存率（58.6%），差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖3。

3 討論

通常來講，歐美發達國家結腸癌的發病率較高，我國發病率目前雖仍低于發達國家，但隨著我國現代化程度和居民生活水平的不斷提高，飲食結構發生較大變化，結腸癌發病率亦隨之增加[4]。目前的研究已經證實，惡性腫瘤的發生與發展是在多種因素參與并作用下，經過多階段演進最終形成的復雜生物學現象。惡性腫瘤細胞最明顯的特征就是增殖的失控性，而與生長、分化有關的細胞信號轉導失調或障礙則是增殖失控的關鍵因素。其中絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）級聯反應是已發現并明確細胞信號轉導途徑之一。在哺乳動物細胞，MAPK轉導途徑的胞外信號已經明確了4條通路：ERK通路、JNK通路、p38通路和ERK－5通路。已證實這些通路的關鍵調節酶在生長因子類蛋白信號刺激引起的細胞反應中起著重要的調控作用。經典的MAPK信號轉導途徑信號蛋白包括：酪氨酸激酶受體和配體蛋白→Ras→Raf→MEK→ERK－1/ERK－2→轉錄因子→細胞增殖、分化等相關基因表達。這條途徑參與了包括細胞增殖、分化、分泌及運動等多種生命活動形式的調節[5]，且在細胞惡性轉化和腫瘤浸潤轉移過程中起著重要作用[6]。MAPK/ERK信號轉導通路在生長因子介導的細胞增殖、分化過程中發揮著重要作用，ERK通路的上、下游調節元件，如位于上游的 c－src、Ras、Raf、v－mos，下游的 c－jun、c－fos、c－myc、c－myb 等均被證明是病毒癌基因，這就提示ERK通路具有惡性轉化細胞的功能。Kawada等[7]研究發現，血管內皮生長因子（VEGF）水平在ERK－2激活后可顯著提高，通過調節結腸癌組織中微血管的生成促進結腸癌組織的生成和發展。Karna等[8]發現ERK傳導通路過度激活可增加成纖維細胞惡性轉化后在裸鼠體內的成瘤及轉移性。Massa等[9]發現成纖維細胞中尿激酶的蛋白水解活性可被ERK激活并誘導。Miyata等[10]發現cos細胞和FG細胞（一種來源于胰腺癌的細胞系）穿過基底膜發生遷移的過程與ERK激活有關。Wang等[11]發現，乳腺癌細胞 MDA－MB－231 中 ERK－2 的活性被MEK的抑制劑PD098059抑制后，其細胞中尿激酶纖維蛋白溶酶原激活劑（u－PA）的表達受到抑制。Guo等[12]則發現，細胞內ERK－2的活性增高的同時，表皮生長因子（EGF）刺激MCF－7細胞具有侵襲性。這些結果均提示ERK－2可能與腫瘤細胞的增殖、轉移、侵襲等活動密切相關。

本組實驗結果顯示，結腸癌組織中ERK－2蛋白陽性表達率[75.9%（60/79）]高于癌旁組織[51.9%（41/79）]及正常組織[13.9%（11/79）]，差異均有統計學意義（P ＜ 0.05或P＜0.01），提示ERK與結腸癌的發生、演進有關。ERK－2蛋白陽性表達率在不同年齡（＜60歲、≥60歲）[77.5%（31/40）、74.4%（29/39）]、性 別（男/女）[70.7%（29/41）、68.4%（26/38）]、Dukes 分期（A、B、C、D 期）[73.3%（11/15）、76.7%（23/30）、71.4%（10/14）、70.0%（14/20）]、CEA 水平（＜5 μg/L、≥5 μg/L）[68.2%（15/22）、64.9%（37/57）]因素間進行比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；ERK－2蛋白陽性表達率在不同分化程度（高中分化/低分化）[82.8%（48/58）、57.1%（12/21）]、浸潤深度（未穿透肌層/漿膜或漿膜外）[46.2%（6/13）、72.7%（48/66）]和淋巴結轉移（陽性/陰性）[76.5%（26/34）、53.3%（24/45）]因素間進行比較，差異有統計學意義（P ＜ 0.05）。

ERK－2蛋白陽性表達還與患者預后有關[13]。本研究中，ERK－2蛋白陽性表達組患者12個月生存率為58.2%，ERK－2蛋白陰性表達組患者12個月生存率為60.4%，兩組比較差異無統計學意義（P＞0.05）；ERK－2蛋白陽性表達組患者24個月生存率為38.7%，低于ERK－2蛋白陰性表達組患者24個月生存率（58.6%），差異有統計學意義（P＜ 0.05）。

本課題通過研究ERK－2蛋白表達與結腸癌臨床病理及預后關系，發現ERK－2在結腸癌的診斷、治療及預后判斷中具有重要的臨床意義，在蛋白分子水平上分析研究結腸癌復發、轉移相關的生物學因素[14－16]，掌握其復發、轉移規律，對改善結腸癌的預后提供了基礎。

[1]Parikh N，Shuck RL，Nguyen TA，et al.Mouse tissues that undergo neoplastic progression after K－Ras activation are distinguished by nuclear translocation of phospho－Erk1/2 and robust tumor suppressor responses[J].Mol Cancer Res，2012，10（6）：845－55.

[2]Kilanczyk，Wasik U，Filipek A.CacyBP/SIP phosphatase activity in neuroblastoma NB2a and colon cancer HCT116 cells[J].Biochem Cell Biol，2012，90（4）：558－564.

[3]Liu J，Shen M，Yue Z，et al.Triptolide inhibits colon－rectal cancer cells proliferation by induction of G1 phase arrest through upregulation of p21[J].Phytomedicine，2012，19（8－9）：756－762.

[4]趙燁宏.結腸癌患者手術治療的療效分析 [J].中國醫藥指南，2012，10（34）：437－438.

[5]Amsterdam A，Shezen E，Raanan C，et al.Two initiation sites of early detection of colon cancer，revealed by localization of pERK1/2 in the nuclei or in aggregates at the perinuclear region of tumor cells[J].Int J Oncol，2012，40（3）：782－788.

[6]Silva M，Jaggers GK，Verstraeten SV，et al.Large procyanidins prevent bile－acid－induced oxidant production and membrane－initiated ERK1/2，p38，and Akt activation in Caco－2 cells[J].Free Radic Biol Med，2012，52（1）：151－159.

[7]KawadaM，SenoH，KandaK，etal.Chitinase3－like1promotesmacrophage recruitment and angiogenesis in colorectal cancer[J].Oncogene，2012，31（26）：3111－3123.

[8]Karna E，Szoka L，Palka J.Thrombin－dependent modulation of β1－integrin－mediated signaling up－regulates prolidase and HIF－1α through p－FAK in colorectal cancer cells[J].Mol Cell Biochem，2012，361（1－2）：235－241.

[9]Massa F，Tormo A，Béraud－Dufour S，et al.Neurotensin－induced Erk1/2 phosphorylation and growth of human colonic cancer cells are independent from growth factors receptors activation[J].Biochem Biophys Res Commun，2011，414（1）：118－122.

[10]Miyata M，Kambe M，Tajima O，et al.Membrane sialidase NEU3 is highly expressed in human melanoma cells promoting cell growth with minimal changes in the composition of gangliosides[J].Cancer Sci，2011，102（12）：2139－2149.

[11]Wang J，Wu J，Hong J，et al.PKC promotes the migration of colon cancer cells by regulating the internalization and recycling of integrin αvβ6[J].Cancer Lett，2011，311（1）：38－47.

[12]Guo D，Zhou H，Wu Y，et al.Involvement of ERK1/2/NF－κB signal transduction pathway in TF/FVⅡa/PAR2－induced proliferation and migration of colon cancer cell SW620[J].Tumour Biol，2011，32（5）：921－930.

[13]Tong QY，Qing Y，Shu D，et al.Deltonin，a steroidal saponin，inhibits colon cancer cell growth in vitro and tumor growth in vivo via induction of apoptosis and antiangiogenesis[J].Cell Physiol Biochem，2011，27（3－4）：233－242.

[14]Slattery ML，Lundgreen A，Herrick JS，et al.Genetic variation in the transforming growth factor－β signaling pathway and survival after diagnosis with colon and rectal cancer[J].Cancer，2011，117（18）：4175－4183.

[15]楊波，高建飛，饒智國，等.原位雜交法檢測結腸癌組織MMP－7 mRNA 的表達及其臨床意義[J].臨床誤診誤治，2012，25（4）：56－58.

[16]Duhamel S，Hébert J，Gaboury L，et al.Sef downregulation by Ras causes MEK1/2 to become aberrantly nuclear localized leading to polyploidy and neoplastic transformation[J].Cancer Res，2012，72（3）：626－635.