腫瘤干細胞在人結腸癌細胞株HT29耐奧沙利鉑中的作用探討

王懷志 趙國強 石獻洲 汪 海 張 建 李懷洲

1.武警河南省總隊醫院普通外科，河南鄭州 450052；2.鄭州大學基礎醫學院，河南鄭州 450052

在我國，結腸癌的發病率和死亡率均較高[1－2]，因此，結腸癌的治療對于民生具有重要的意義。奧沙利鉑（Oxaliplatin，L－OHP）是一種鉑類化療藥物，是治療結腸癌的一線化療藥物。但是結腸癌細胞容易對L－OHP產生耐藥性，這是結腸癌化療失敗的主要原因之一[3]。許多研究對這一現象及其機制進行了探討[4－5]，但是腫瘤干細胞（cancer stem cell，CSC）是否參與了這一過程并不清楚。本研究以L－OHP為誘導劑，建立了人結腸癌L－OHP耐藥細胞株，觀察了腫瘤干細胞標志物的表達，以探討CSC在結腸癌細胞對L－OHP產生獲得性耐藥中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

人結腸癌細胞株HT29購自南京凱基科技生物發展有限公司；MTT試劑盒購自美國Sigma公司；L－OHP購自江蘇恒瑞醫藥股份有限公司；TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司；RPMI 1640培養基和小牛血清購自美國Gibico公司；As2O3購自哈爾濱伊達藥業有限公司；RNA提取試劑盒購自德國QIAGEN公司；逆轉錄酶和Taq酶購自美國Promega公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養

HT29的耐藥株和親本株均采用RPMI 1640（含10%的小牛血清）培養，于恒溫37℃且含有5%體積CO2的細胞培養箱中培養。

1.2.2 人結腸癌耐L-OHP細胞株的誘導

采用藥物濃度遞增和間歇誘導相結合的方法誘導人結腸癌耐L－OHP細胞株。L－OHP濃度從4 μmol/L開始最終增加到 16 μmol/L，最終獲得可耐受 16 μmol/L L－OHP的細胞HT29細胞株，命名為HT29/L－OHP，維持培養于含4 μmol/L L－OHP的正常培養液中，后續實驗前1周撤藥。

1.2.3 MTT法

MTT是一種染料，在活細胞的作用下，外源性的MTT被線粒體中的琥珀酸脫氫酶轉變為藍紫色結晶物，采用二甲基亞砜溶解此結晶物后，在540 nm波長處測定光密度值，可以根據此光密度值間接推算活細胞的數量。

1.2.4 生長曲線測定

將對數生長期的HT29及HT29/L－OHP細胞制成細胞懸液，細胞密度調整為1.5×104/mL，接種于96孔板中，MTT法測定每孔的吸光度（OD值），連續測定7 d，繪制生長曲線。 倍增時間計算公式如下：TD=T×lg2/lg（Nt/N0），其中，TD為倍增時間（h），T為細胞數目由N0增殖到至Nt所用的時間。 整個實驗分為三組：HT29/L－OHP+L－OHP 組（12 μmol/L L－OHP 處理 的 HT29/L－OHP 細 胞 ），HT29+L－OHP 組（12 μmol/L L－OHP 處理的 HT29 細胞），HT29 組（無 L－OHP的HT29細胞）。

1.2.5 HT29和HT29/L-OHP細胞對L-OHP敏感性的測定

將HT29及HT29/L－OHP細胞接種于96孔板中，采用不同濃度的 L－OHP 處理，所用濃度分別為 0.1、1、10、100、1000 μmol/L。培養72 h后測定每孔的吸光度，計算細胞存活率、半數抑制濃度（IC50）和耐藥指數（resistance index，RI）。細胞存活率=實驗組OD值/對照組OD值×100%。RI=耐藥細胞IC50/親本細胞IC50。

1.2.6 As2O3細胞毒性實驗

將HT29及HT29/L－OHP細胞接種于96孔板中，采用不同濃度的As2O3處理細胞，所用濃度分別為0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 mg/L。培養72 h后測定每孔的吸光度，計算細胞抑制率。 細胞抑制率=[1－（AX－A）/（A0－A）]×100%，其中，AX為加藥組的OD值，A0為空白對照組的OD值，A為單純培養液組的OD值。

1.2.7 As2O3對HT29/L-OHP細胞耐藥性的逆轉

根據細胞毒性實驗結果，選取無細胞毒劑量的As2O3進行實驗。加入As2O372 h后測定HT29/L－OHP細胞對L－OHP的敏感性，計算IC50，并計算逆轉倍數和相對逆轉效率。逆轉倍數=HT29/L－OHP的IC50/加入As2O3后HT29/L－OHP 的 IC50。 相對逆轉效率=（HT29/L－OHP 逆轉前IC50－ HT29/L－OHP逆轉后 IC50）/（ HT29/L－OHP逆轉前IC50－ HT 的 IC50）。

1.2.8 實時熒光定量PCR

1.2.8.1 引物設計 采用引物在線軟件設計引物并檢測分析（blast.ncbi.nlm.nih.gov），最后由上海生物工程有限公司合成，引物序列（5'→3'）見表1。

表1 擴增引物及擴增片段長度

1.2.8.2 總RNA的提取和逆轉錄 取對數生長期的耐藥株和親本株HT29細胞，采用RNA提取試劑盒提取總RNA并進行逆轉錄反應，得到的cDNA用于實時熒光定量PCR。

1.2.8.3 實時熒光定量PCR反應 反應體系：SYBR Premix Ex TaqTM（2×） 10 μL，Forword primer 0.4 μL，Reverse primer 0.4 μL，ROX Reference Dye（50×）0.4 μL，cDNA 2 μL，dH2O 6.4 μL。 反應條件：95℃變性 15 min，擴增 40循環，每循環變性 15 s，60℃退火 30 s，72℃ 30 s。 采用△△Ct法進行相對定量分析。

1.3 統計學方法

采用SPSS 10.0統計軟件包進行數據處理，計量資料進行方差齊性分析和正態分布檢驗，方差齊且呈正態分布的數據，組間比較采用單因素方差分析；方差不齊或者非正態分布數據均進行變量變換，變換后再進行方差齊性分析和正態分布檢驗，若變換后仍方差不齊或者非正態分布的數據，對其進行非參數檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 人結腸癌耐藥細胞株HT29/L-OHP的鑒定

MTT 結果顯示，L－OHP（12 μmol/L）存在的情況下，在第1、2天時，HT29/L－OHP和HT29細胞的增殖速度差異無統計學意義（P ＞ 0.05），但是在第 3～7 天，HT29/L－OHP細胞增殖速度顯著高于HT29細胞（P＜0.01）（圖1）。HT29/L－OHP細胞的倍增時間為28.7 h，低于HT29細胞（45.1 h）。同無L－OHP作用的HT29細胞相比，HT29/L－OHP細胞的增殖速度無顯著改變（P ＞ 0.05）（圖1），HT29/L－OHP 細胞的倍增時間接近于無L－OHP作用的HT29細胞（26.3 h）。MTT結果顯示，HT29/L－OHP 細胞的 IC50為 138.4 μmol/L，HT29細胞的 IC50為 12.1 μmol/L，RI為 11.44。

2.2 As2O3細胞毒性實驗結果

結果表明，0.25 mg/L的As2O3對HT29細胞無毒性反應，但是當濃度超過0.25 mg/L時，As2O3呈現出劑量依賴性的毒性效應（表2），可以認為0.20 mg/L的As2O3為無細胞毒性劑量。

表2 不同濃度As2O3的細胞毒性測定（±s）

表2 不同濃度As2O3的細胞毒性測定（±s）

As2O3（mg/L）0.25抑制率（%）HT29 HT29/L－OHP 0.5 124 0.07±0.02 0.29±0.06 0.46±0.10 0.63±0.11 0.87±0.09 0.06±0.02 0.26±0.05 0.42±0.09 0.54±0.10 0.81±0.08

2.3 As2O3對HT29/L-OHP細胞耐藥性的逆轉

As2O3（0.20 mg/L）預處理后，MTT 結果顯示，在 L－OHP（12 μmol/L） 存在的情況下，在第 1～5 天時，HT29/L－OHP 和HT29細胞的增殖速度差異無統計學意義（P＞0.05，圖2），但是在第6、7天，HT29/L－OHP細胞增殖速度顯著高于HT29細胞（P ＜ 0.05，圖2）；統計結果表明，HT29/L－OHP 細胞的倍增時間為39.8 h，與HT29細胞倍增時間的差距減?。?6.3 h）。結果還表明，同無L－OHP作用的HT29細胞相比，在第1、2天時，HT29/L－OHP細胞的增殖速度無顯著改變（P ＞ 0.05，圖2），但是在第 3～7 天，HT29/L－OHP 細胞的增殖速度降低（P＜0.05，圖2），其倍增時間高于無L－OHP作用的HT29細胞（28.6 h）。MTT結果還表明，As2O3（0.20 mg/L）預處理后，HT29/L－OHP 細胞的 IC50為 36.8 μmol/L，逆轉倍數為3.76，相對逆轉效率為80.4%。

2.4 Sox-2、miR-200c和 let-7的表達

實時熒光定量PCR結果表明，相對于HT29細胞，HT29/L－OHP細胞的Sox－2的表達顯著增強（P＜0.01），但是mir－200c 和 let－7 的表達顯著下降（P ＜ 0.05）；As2O3（0.20 mg/L）預處理后，相對于逆轉之前的HT29/L－OHP細胞，HT29/L－OHP細胞中 Sox－2的表達顯著降低（P＜0.05），mir－200c和 let－7 的表達顯著升高（P ＜ 0.05）。 見表3。

表3 各組間Sox-2、miR-200c和let-7基因表達情況（±s）

表3 各組間Sox-2、miR-200c和let-7基因表達情況（±s）

注：與 HT29組比較，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01；與 HT29/L－OHP 組比較，#P＜0.05

組別 Sox－2 miR－200c let－7 HT29組HT29/L－OHP 組As2O3+HT29/L－OHP 組0.019±0.010 0.072±0.038**0.032±0.012#0.726±0.289 0.262±0.136*0.367±0.256#0.642±0.268 0.213±0.145*0.3869±0.253#

3 討論

本研究首先采用藥物濃度遞增和間歇誘導相結合的方法誘導產生了人結腸癌HT29/L－OHP耐藥細胞株。生長曲線分析表明，在L－OHP的作用下，HT29/L－OHP細胞的增殖速度顯著高于HT29細胞，說明HT29/L－OHP細胞對L－OHP的耐受性顯著高于HT29細胞。結果還發現，同未經L－OHP作用的HT29細胞相比，L－OHP作用下的HT29/L－OHP細胞的增殖速度未見顯著降低，說明經過長時間誘導后，HT29/L－OHP細胞恢復了增殖能力。L－OHP敏感性測定結果表明，HT29/L－OHP細胞的IC50高于HT29細胞，RI為 11.44，說明 HT29/L－OHP 細胞對 L－OHP 高度耐藥[6]。綜合以上結果，本研究成功建立了能夠在L－OHP作用下穩定生長的HT29/L－OHP耐藥細胞株。

多項研究表明，CSC是多種腫瘤細胞產生化療藥物耐藥性的重要機制之一[7－8]，但是CSC在結腸癌細胞對L－OHP耐藥中的作用并不清楚。為了探討CSC是否參與了結腸癌細胞的耐藥過程，本研究采用實時熒光定量PCR觀察了與干細胞相關的標記物的表達。Sox－2是一種具有很強特異性的胚胎干細胞標記物，在干細胞中的表達較強[9－10]。miR－200c和let－7是兩種微小RNA，與腫瘤的發生發展、侵襲和分化等過程密切相關，在CSC中表現為低表達[11－12]。本研究中，相對于HT29細胞，HT29/L－OHP細胞Sox－2的表達顯著增加，而miR－200c和let－7的表達顯著下降，說明誘導HT29細胞獲得對L－OHP的耐藥性后，HT29/LOHP細胞的干細胞特性增強。

為了進一步研究CSC的作用，本研究采用As2O3逆轉了HT29/L－OHP細胞的耐藥性，觀察了干細胞相關的標記物的表達。細胞毒性實驗表明，在劑量超過0.25 mg/L時，As2O3對結腸癌細胞系表現出劑量依賴性的毒性效應，筆者預實驗表明，0.20 mg/L的As2O3對HT29細胞和HT29/L－OHP細胞均無毒性效應。因此，可以認為0.20 mg/L的As2O3為無細胞毒性劑量，與文獻報道一致[13]。0.20 mg/L As2O3處理72 h后，HT29/L－OHP細胞的增殖速度和 IC50均顯著降低，表明成功逆轉了HT29/L－OHP細胞的耐藥性。實時熒光定量PCR表明，As2O3處理后，同未處理前相比，HT29/L－OHP 細胞 Sox－2的表達顯著下降，而 miR－200c和let－7的表達顯著增加，說明隨著耐藥性的下降，HT29/LOHP細胞的干細胞特性減弱。

綜上所述，本研究認為CSC有可能是HT29細胞對L－OHP產生耐藥性的重要機制之一。

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