結核分枝桿菌三種基因重組質粒的構建及原核表達＊

丁淑琴，師志云，董 輝，楊風琴，朱佳佳

（1.寧夏醫科大學檢驗學院，寧夏銀川 750004；2.寧夏醫科大學總醫院醫學實驗中心，寧夏銀川 750004）

結核病是由結核分枝桿菌長期感染引起的最古老的傳染病，嚴重危害著人類的健康。我國目前結核病疫情依然相當嚴重，部分地區有蔓延趨勢。估算全國現有傳染性肺結核病患者200萬人，是當前農村中因病致貧、因病返貧的主要原因之一［1］。因此，早期發現、早期診斷是防治結核病最關鍵的問題。傳統的細菌學檢查仍是結核病實驗室診斷的金標準。但由于該法涂片陽性率低，細菌培養費時間。近年來，多種血清學和分子生物學診斷方法已用于結核分枝桿菌的直接檢測、菌種鑒定和藥物敏感實驗，極大地縮短了診斷時間。分子生物學檢查雖然快速，靈敏，但操作煩瑣，技術要求高，難以廣泛運用。而血清學實驗由于其敏感、快速的特點是診斷結核病的一種有效手段，因此，尋找特異性強，純度高的結核分枝桿菌抗原成為人們關注的焦點［2－4］。本研究擬將 ESAT-6、CFP-10、phoS2基因克隆到原核表達載體pET28a中，并進行原核表達，為后續的蛋白純化等結核病診斷和防治研究工作奠定基礎并提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質粒與菌種 pET-28a表達載體購自Novagen公司。E.coli BL21（DE3）plysS由本室保存，ESAT-6、CFP10、phoS2／pGEM-T／JM109質粒由本教研室構建［5－7］。

1.1.2 酶與主要試劑 限制性內切酶BamH I、Xohl I及T4連接酶均購自Promega公司；DNA回收試劑盒、200bp DNA分子標記物、低分子量蛋白質分子標記物、購自北京賽百盛生物工程公司；卡那霉素購自AMRESCO；DNA回收試劑盒購自天根生物工程公司。

1.2 方法

1.2.1 重組表達質粒的構建 經藍白斑篩選白色菌落擴增培養，堿裂解法提取重組質粒 ESAT-6、CFP10、phoS2／pGEMT。取重組質粒和表達載體pET-28a，兩者分別用BamHI和Xohl I進行雙酶切處理，用1%的瓊脂糖凝膠電泳分離帶有雙黏性末端的目的片段和表達載體，經DNA切膠回收試劑盒純化目的片段及載體。目的片段與表達載體在T4連接酶的作用下，4℃連接反應過夜。以空載體作為對照，其產物轉化入BL21菌，用含卡那霉素（終濃度為50μg／mL）的選擇培養基篩選出陽性菌落。

1.2.2 重組表達質粒的鑒定 挑取白色陽性菌落，采用菌落PCR法對陽性質粒進行鑒定。菌落PCR反應組成為：10×緩沖液（含 Mg2＋）2.5μL，10mmol dNTP 0.5μL，引物1和引物2各0.5μL，TaqDNA酶0.5μL，ddH2O 20.5μL，挑取白色菌落一個為DNA模板，同時以藍色菌落做對照。反應條件為：94℃4min；94℃30s，60 ℃ 30s，72 ℃ 30s，30個循環；72℃7min。反應結束，1.5%瓊脂糖膠進行鑒定。

1.2.3 重組蛋白的表達 將重組質粒轉化至感受態細胞BL21（DE3）中；次日早上，在轉化平皿中挑取單菌落接種含卡那霉素的5mL 5052自誘導液體培養基（50mmol／L Na2HPO4，50mmol／L KH2PO4，50mM NH4Cl，5mM Na2SO4，2mM MgSO4，0.2×微量金屬，0.5%甘油，0.06%葡萄糖，0.20%乳糖）［8］，于37℃振蕩培養過夜；培養4～5h，按1∶200比例接種含相應抗生素新鮮的5052液體培養基；振蕩培養，過夜誘導表達［9］。分別在20℃、25℃、30℃條件下以誘導表達選擇最優表達條件。

1.2.4 重組蛋白的鑒定 6 000r／min離心5min，棄上清，收集細菌沉淀。將樣本經SDS-PAGE、180V電壓電泳1h，用0.2%考馬斯亮藍R250染色后，用脫色液脫至本底無色為止。

2 結 果

2.1 重組質粒的構建及鑒定 挑選陽性菌落，用菌落PCR的方法對重組質粒進行鑒定，1%瓊脂糖凝膠電泳結果顯示白色陽性菌落擴增出大小與預期一致的DNA片段，如圖1、2、3所示。初步表明重組表達質粒構建成功。重組質粒經測序表明ESAT-6、CFP10、phoS2目的片段完整開放閱讀框與GeneBank中檢索到的結核桿菌H37Rv株基因序列完全一致。

圖1 ESAT-6／pET28a菌落PCR鑒定

2.2 重組蛋白的原核表達及鑒定 分別將20℃、25℃、30℃誘導表達菌超聲破碎后的上清液和沉淀分別進行SDS-PAGE分析，結果顯示：25℃時ESAT-6和phoS2表達產物量最大，沉淀分別在10KDa、31KDa處可見較明顯的特異蛋白表達帶，而上清液中只見極少量特異蛋白表達帶，說明表達的重組蛋白多數為沉淀，說明以細胞內包涵體形式存在。而任何溫度下CFP10都不表達。

圖2 25℃誘導表達產物鑒定

3 討 論

pET系統是E.coli中克隆表達重組蛋白功能最強大的系統，被廣泛應用于重組蛋白的表達和純化中。pET-28a是其中的一種具有高效表達的能力的表達載體［10］。此外，由于pET28a質粒在插入目的DNA后表達的蛋白N末端含6個組氨酸，它可作為His標簽蛋白，可通過形成配位鍵與金屬螯合親和層析柱上固定化的某些二價金屬離子（如鎳）結合，使得重組融合蛋白在變性或非變性狀態下均可被含Ni2＋的Hisband樹脂親合柱純化，即使被純化的重組蛋白含量很低也能被有效地純化出來。基于以上兩點，筆者選擇了該表達載體，質粒構建實驗中筆者用菌落PCR的方法對陽性質粒進行鑒定，1%瓊脂糖凝膠電泳結果顯示白色陽性菌落擴增出大小與預期一致的DNA片段。初步表明重組表達質粒構建成功。重組質粒經測序表明ESAT-6、CFP10、phoS2目的片段完整開放閱讀框與GeneBank中檢索到的結核桿菌H37Rv株基因序列完全一致。

三種重組蛋白的原核表達實驗，筆者查閱了相關文獻，選用了5052自誘導培養基，其自動誘導蛋白質合成的主要原因是lactose被降解成半乳糖從而誘導蛋白質合成。自誘導培養基的優勢在于它無需監測培養基的混濁度，無需添加誘導劑，單位體積的培養基比傳統的IPTG誘導法產出更高量的目的蛋白。我們改變誘導溫度，分別在20℃、25℃、30℃條件下進行表達以選擇最優表達條件。三種重組蛋白的原核表達結果顯示，25℃時ESAT-6和phoS2表達產物量最大，上清液中只見極少量特異蛋白表達帶，表達的重組蛋白多數為沉淀，說明以細胞內包涵體形式存在。故無法進行有效的純化和分離。而任何溫度下CFP10都不表達。這些為后續實驗帶來了很大的困難，甚至可能影響其今后的實用價值。筆者也通過常規的稀釋，透析等方法對包涵體進行復性，但蛋白復性率均很低。鑒于此，要想得到表達量更多、純度更高的重組蛋白，下一步方案是更換表達載體。本研究為后續表達質粒的重新構建、蛋白的表達及純化提供了理論依據。

［1］ 張小飄.淺談結核病實驗診斷技術的新進展［M］.臨床肺科雜志，2011，16（1）：90-91.

［2］ Doherty TM，Demissie A，Olobo J，et al.Immune responses to the Mycobacterium tuberculosis specific antigen ESAT-6signal subclinical infection arroag contacts of tuberculosis patients［J］.J Clin Micmblol，2002，40（6）：704-706.

［3］ Davin CD，Mark RA，Craig HD，et al.Molecular and immunological characterization of M ycobacterium tuberculosis CFP10，an immunodiagnostic antigen missing in Mycobacterium bivis BCG［J］.J ClinMicrobiolo，2000，38（9）：3285-3290.

［4］ Romano M，Roupie V，Hamard M.Evaluation of the immunogenicity of pBudCE4.1plasmids encoding mycolyltransferase Ag85Aand phosphate transport receptor PstS-3from Mycobacterium tuberculosis［J］.Vaccine，2006，24（21）：4640-4643.

［5］ 朱佳佳，劉宏鵬，張愛君，等.結核分枝桿菌ESAT-6診斷抗原基因的克隆及同源性分析［J］.寧夏醫科大學學報，2010，32（3）：339-341.

［6］ 丁淑琴，王淑靜，王潔，等.結核分枝桿菌CFP10特異性診斷抗原基因的克隆及特性分析［J］.寧夏醫學雜志，2010，32（5）：387-388.

［7］ 丁淑琴，王潔，張焱，等.結核分枝桿菌phoS2基因的克隆及序列分析［J］.寧夏醫科大學學報，2010，32（6）：669-673.

［8］ 馮杉.T7表達系統及自誘導蛋白產出策略［J］.北京教育學院學報（自然科學版），2009，4（3）：10-15.

［9］ Studier FW，Protein production by auto-induction in highdensity shaking cultures［J］.Protein Exper Purif，2005，41（2）：207-234.

［10］Tabor S，Richardson CC.A bacteriophage T7RNA polymerase／promoter system for controlled exclusive expression of specicic genes［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1985，82（3）：1074-1078.