針康法對局灶性腦缺血大鼠運動功能及缺血區周圍內皮素受體－β表達的影響*

唐 強，王宏宇，王 艷，邢艷麗，朱路文

(1．黑龍江中醫藥大學附屬第二醫院，黑龍江哈爾濱150001;2．黑龍江中醫藥大學，黑龍江哈爾濱150040)

缺血性卒中是臨床常見病和多發病，隨著診療技術的提高，其死亡率呈降低趨勢，但后遺癱瘓率仍居高不下［1－2］。因此，如何減輕梗死后功能障礙已成為康復醫學研究的重點［3］。缺血早期的微血管痙攣是造成腦損傷加重的重要因素［4］，ET－β受體正是具有強烈血管收縮效應物質－內皮素(ETs)的受體之一［5］，相關動物實驗表明大鼠pMCAO后可導致ETs增加并作用于ET－β受體，使缺血區微血管痙攣，側支血流無力進入高壓力的痙攣血管內，缺血腦組織不能獲得血氧供給，造成神經元的嚴重缺血而衰亡。本實驗通過觀察針康法對局灶性腦缺血大鼠缺血區周圍ET－β受體表達的影響及對大鼠運動功能進行行為學評定，探討針康法的作用機制。

1 材料與方法

1．1 實驗動物及分組

選取健康清潔級雄性Sprague－Dawley大鼠120只，體重(250±30)g，由黑龍江中醫藥大學實驗動物中心提供。按照隨機數字表法將120只大鼠隨機分為5組:假手術組、模型組、針刺組、康復組以及針康組，再按腦缺血后的不同分為3天、7天、14天、21天共4個亞組，每組6只。

1．2 實驗試劑和儀器

試劑:兔抗多克隆一抗為武漢博士德和北京博奧森PV6001(北京中山)，其它包括國產分析純。儀器:美國moticam3000顯微攝影成像系統，德國菜卡2135型切片機，上海一恒電熱恒溫箱，醫用微波爐、華佗牌針灸針，OSPT－202六道電動跑臺(北京立泰生物科技公司)。

1．3 造模方法

造模前進行1周電動跑臺適應性訓練(速度:10 m/min)，每天訓練20 min。模型制備:大鼠造模前禁食不禁水24 h后稱重，選用直徑0．20～0．50 mm的強力釣魚線，剪成長20 mm的栓線，并將一端修理成光滑球形，以10%水合氯醛(0．3 ml/100 g)行腹腔注射麻醉，將麻醉后大鼠四肢固定，頸部備皮、碘伏消毒后，行正中切口，鈍性分離皮下結構，使頸總動脈暴露，同樣暴露迷走神經頸內動脈和頸外動脈。參考Longa EZ方法［6］于頸總動脈近分叉處切口，插入與體質量相應直徑的線栓，收緊備線，線栓沿頸內動脈推進，當進入約18 mm，可有輕微阻力感，證明線栓頭端已達大腦中動脈處，扎緊備線，縫合，腹腔注射青霉素溶液防止傷口感染，術后動物注意保暖 。術后6 h參照 Longa EZ［6］的5分法進行評分。0分:無神經功能缺損癥狀;1分:輕度局灶性神經功能缺損，即提尾懸空不能伸展左側前爪;2分:中度局灶性神經功能缺損，即行走向左側轉圈;3分:重度局灶性神經功能缺損，即行走困難，并向左側傾倒;4分:不能自發行走，意識水平下降。造模成功標準:評分為1～3分，剔除不合格大鼠，隨時補充模型動物以保證每組只數固定。

1．4 干預方法

1．4．1 模型組 不予任何干預，造模后放回籠中，安靜飼養按時間點進行行為學評定。

1．4．2 假手術組 不予任何干預，術后放回籠中，安靜飼養按時間點進行行為學評定

1．4．3 針刺組 造模后24 h僅給予頭穴叢刺干預，按照“大鼠穴位圖譜”所示，取百會穴、百會左右側旁開4 mm處向前或從頂前區顱中線及左右側各旁開4 mm處向后進行針刺(應用頭穴叢刺法)，以上針刺區域覆蓋大鼠頂區、頂前區，進針后快速捻轉1 min后留針3 h。

1．4．4 康復組 造模24 h后，將大鼠置于不斷向后傳輸的履帶上，大鼠不斷地在電動履帶上主動向前奔跑，以求避免履帶尾部電柵欄的電擊。運動跑臺訓練方案，每天訓練20 min，速度:1～3天為5 m/min，4～14 天為 10 m/min，14 天后為15 m/min［7］。

1．4．5 針康組 造模后24 h同步同時進行頭穴叢刺法結合跑臺訓練，方法同針刺組和康復組。

1．5 行為學評估方法

各組大鼠于造模后3天、7天、14天和21天4個時間點每組各6只大鼠，進行網屏試驗，評估其運動功能。網屏試驗:大鼠前爪抓住網屏可達5 s，且不滑落為0分;大鼠能夠握住網屏，并且滑落一段距離，但未掉下為1分;大鼠在5 s內掉下為2分;網屏轉動時大鼠即掉下為 3 分［8］。

1．6 標本采集及免疫組織化學染色

1．6．1 標本采集 各組大鼠在相應時間點進行運動功能評定后，將其麻醉且固定于手術臺，使其心臟暴露，先后用0．9%生理鹽水及4%多聚甲醛溶液各200 ml心臟灌注，將體內血液沖凈(從右房流出的液體變清)，然后斷頭取腦，將腦組織存放入4%多聚甲醛溶液中固定，以備觀察免疫組織化學。

1．6．2 免疫組織化學染色 分別經過脫水－透明－浸蠟－包埋－切片－脫蠟－脫水。滴加一抗(ET－β多克隆抗體)，PBS每次沖洗2 min共3次。滴加相應二抗，PBS沖洗2 min共3次。DAB顯色，蒸餾水洗滌，蘇木素復染，脫水、透明、封片，顯微鏡下觀察效果。

1．7 圖片分析

在高倍鏡(×400)下于梗死灶周圍避開白質區神經核團隨機選5個視野，統計出每個視野內呈現小膠質細胞形態的ET－β受體陽性細胞數，30個視野的平均數代表該標本的陽性細胞數。

1．8 統計學分析

應用SPSS17．0統計軟件處理，組內比較采用重復測量方差分析，組間比較采用單因素方差分析方法，若方差齊，則采用LSD法進行分析，若方差不齊，則采用Dunnett法進行分析。

2 結果

2．1 運動功能

假手術組大鼠麻醉蘇醒后活動正常，這說明了假手術本身并未對大鼠的神經功能以及運動功能造成影響。模型組各時期運動功能評分顯著高于假手術組(P＜0．05)，具有統計學意義。針康組在3天和7天時評分與模型組無顯著性差異(P＞0．05)，不具有統計學意義，14天和21天時評分低于模型組(P＜0.05)。見表1。

表1 各組大鼠不同時間點的運動功能評定比較

2．2 免疫組織化學指標試驗結果

造模后大鼠腦梗死灶周圍ET－β受體于3天時均有表達，見封三彩圖1(陽性表達呈黃色或棕黃色)，并且分別在3天和7天時達到高峰，隨后有不同程度的下降。與模型組相比，假手術組3天、7天和14天時有顯著性差異(P＜0．05)，針康組和模型組相比，在3天、7天、和14天均有顯著性差異(P＜0．05);與針刺組和康復組相比，針康組ET－β受體陽性細胞表達較少，造模后3天和7天均有顯著性差異(P＜0．05)，見封三彩圖2，相對于其它組別以較快的速度減低;21天時模型組、康復組、針刺組、針康組比較，差異無統計學意義(P＞0．05)。見表2。

表2 各組缺血區周圍ET－β受體陽性細胞數比較(400×)(ˉx±s)

3 討論

針康法是由唐強教授［1］提出的康復理念，其方法是采用頭穴叢刺結合康復訓練治療腦卒中。針康法具有雙向調節功能，頭穴叢刺的刺激信號能夠透過顱骨直接刺激大腦皮質，以達到作用于中樞神經系統而改 善患側運動功能之目的，頭穴叢刺的同時進行運動訓練使患側重復運動信號向中樞神經系統傳導，使遭到破壞的大腦運動支配區產生周圍代償、遠隔代償，局部功能重組［1］。針灸專家于致順［9］最早提出頭穴叢刺法這一概念，它是一種治療腦梗死的有效方法，又分為七區劃分法和長留針法。在長留針期間可以進行手法行針從而達到足夠有效刺激量目的。頭穴叢刺達到足夠的刺激量可透過顱骨直接對大腦皮質神經產生刺激作用，從而改善神經細胞功能［10］，并且可以抑制神經細胞凋亡從而減緩由凋亡造成的腦損傷［11，12］。康復療法可以改善腦卒中運動、感覺、平衡等功能障礙，出現可塑性變化，使受損的大腦功能得到改善［13］，相關實驗表明，動物跑臺訓練能縮小腦梗死體積，促進神經功能的恢復［14］。

內皮素－B(endothelin－β，ET－β)受體是內皮素(endothelins，ETs)的一種特殊的 G 蛋白耦聯受體［15］。ETs是一種具有強烈血管收縮效應的物質，是體內一種神經調節因子，起局部激素作用。有研究表明，腦缺血可導致ETs增加并作用于ET－β受體，誘導星形膠質細胞釋放谷氨酸，加重神經元退行性變性［16］。Morga等［17］發現ET－β受體可增加一氧化氮釋放，從而產生神經毒性作用。

為了更接近于臨床康復中的實際情況，本實驗各干預組在介入時間、單次訓練時間及訓練強度由小到大。實驗結果顯示，大鼠pMCAO造模后，針康組、針刺組、康復組、模型組大鼠半暗區內有大量ET－β受體陽性細胞，以缺血后3天、7天達高峰，之后總體峰值減低，21天時基本與假手術組相當。此變化規律與Morga等［17］發現一致。針康組大鼠腦梗死灶周圍ET－β受體表達較模型組明顯減少，與其它干預組相比，在3天、7天和14天時ET－β受體表達數目明顯減少(P＜0．05)。在動物行為學評分發面，各組不同時間點的動物行為學評分，針康組均低于同期康復組、針刺組、模型組。本實驗建立了針康法對神經功能的恢復和腦組織ET－β受體表達的關系:針康法能夠降低大鼠腦梗死灶周圍ET－β受體的表達，并加快其下降的趨勢，從而有效地緩解血管痙攣，使缺血區腦組織細胞及時得到血流，及早地逆轉惡性發病過程，并且減少其對神經元產生神經毒性作用，從而促進腦梗死后神經的再生，增加中樞神經系統的修復能力。

綜上所述，本研究表明，相對于單純的康復療法，針康法能較好促進腦梗死大鼠運動功能的恢復，其機制可能與腦梗死灶周邊區的ET－β受體陽性細胞數減少有關，其具體作用機制有待于進一步的研究。

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